论文摘要
分子标记辅助选择与传统育种方法的结合加速了猪遗传改良的进程。分子标记辅助选择的基础是寻找与重要经济性状相关的主效基因和分子标记。随着猪分子遗传图谱、QTL定位以及人、鼠等功能基因组研究的深入，通过报道的QTL-定位结果，在与之同源的人鼠等染色体区域内，确定经济性状相关候选基因是切实可行的，基于此，本研究筛选了8个与肌肉代谢相关基因作为猪生产性状候选基因进行了研究，并取得了以下结果：1、HK2（HexokinaseⅡ，己糖激酶2）：（1）获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种基因编码区序列和部分基因组序列，并提交到GenBank中，获得四个登录号为DQ432056、DQ432057、AY818385、AY821788；（2）序列比对发现了13处cSNPs（single nucleotide polymorphism in coding sequence）和2处3’非翻译区的SNP；内含子中发现了38个SNPs；（3）建立了第10内含子A／G替换的PCR-MspⅠ-RFLP（MspⅠ酶切片段长度多态性）和第17外显子的T／G替换的PCR-MspⅠ-RFLP分型方法，在所检测的6个不同猪种中，第10内含子的多态在大白和长白猪中只出现了A等位基因；国内猪种可检测到A和B等位基因；第17外显子的多态在所检测的6个不同猪群中A等位基因只存在于杂合子个体中，各猪群中两等位基因频率没有多大差异。（4）在309头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，第10内含子的多态位点与眼肌高度、平均皮厚和股二头肌大理石纹差异显著，并且加性效应显著；在186头试验猪群（大白、长白、梅山、大白×梅山、长白×大白、大白×长白）中进行标记性状关联分析，第17外显子的多态位点与胴体长、肋骨数、肩部背膘厚和眼肌面积差异极显著，与胸腰椎间背膘厚、三点平均背膘厚、眼肌高度、眼肌宽度、肥肉率、瘦肉率和肌内脂肪差异显著。（5）该基因在猪骨骼肌中特异性表达。2、LMCD1（LIM and cysteine-rich domains 1，LIM富半胱氨酸区域蛋白1）：（1）获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种基因编码区序列并提交到GenBank中，登录号为NM001008692；（2）序列比对发现了4个cSNPs，其中1处预测可导致氨基酸改变；（3）建立了第三外显子G／A替换的SSCP（polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism）基因分型方法。在所检测的6个猪种中，大白、长白、鄂西黑和皖南花猪种G等位基因的基因频率为1或接近1，而梅山和清平品种的等位基因G基因频率分别为0.2889和0；（4）在178头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，该位点与胸腰椎间背膘厚和臀部平均背膘厚差异显著，该位点以显性作用方式为主，且方向一致；（5）该基因在所检测的各组织中均有表达，在心脏和肌肉中表达量最高。3、NRAP（Nebulin-related anchoring protein，伴肌动蛋白相关锚定蛋白）：（1）获得了大白猪、杜洛克猪、梅山猪三个猪种基因编码序列、5’RACE（rapid amplificationof cDNA end，快速扩增cDNA末端）及其第39、40内含子序列，序列已提交到GenBank中，登录号为DQ157553和DQ480149；（2）发现了35个SNPs，其中3处预测可导致氨基酸改变；（3）建立了第39内含子A／G替换的PCR-Eco721-RFLP分型方法；在所检测的8个猪种中，大白、长白猪种B等位基因的基因频率为1，中国地方猪群可检测到A和B等位基因；（4）在302头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，该位点与出生重、内脂率、眼肌高度、肩部背膘厚、背最长肌pH值、失水力、系水力、背最长肌肌肉色值、股二头肌pH值和股二头肌色值显著或极显著相关，该位点在胴体性状以显性作用方式为主，肉质性状则以加性作用为主；（5）该基因特异性的在心脏和骨骼肌中表达。4、ECHI （Enoyl CoA hydramse 1，烯酯酰辅酶A水合酶1）：（1）获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种基因编码序列、5’RACE及第3内含子外的所有内含子序列，并提交到序列的GenBank登录号为DQ157552和DQ480146；（2）序列比对发现了17个SNPs，其中1处cSNP；（3）建立了第1内含子A／G替换的PCR-BamHⅠ-RFLP、第5内含子A／G替换的PCR-PstⅠ-RFLP分型方法和第4外显子T／C突变的PCR-SSCP分型方法；第1内含子的酶切多态，在所检测的7个猪种中，大白和长白猪种B等位基因的基因频率接近为1，而中国猪种均可检测到A和B等位基因，除清平猪种外，其余品种均为B等位基因占优势；关于第5内含子多态性分布，在所检测的7个猪种中，监利猪未检测到A等位基因，其余猪种均可检测到A和B等位基因，均为B等位基因占优势；（4）在296头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，第1内含子多态的不同基因型间内脂率、眼肌高度和肌内水分等生产性状差异显著，以显性效应为主；在306头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，第5内含子位点与屠宰率、平均皮厚和股二头肌色值差异显著；（5）该基因在所检测的9个组织中均表达。5、CKMT2 （crcatine kinase，mitochondrial 2（sarcomeric），肌节线粒体肌酸激酶2）：（1）获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种基因cDNA序列，该基因GenBank登录号为DQ363337，获得的第4内含子序列见附录14；（2）序列比对，发现了9个SNPs，其中3处预测可导致氨基酸改变；（3）建立了第4内含子A／G替换的PCR-MspⅠ-RFLP分型方法，在检测的9个猪种中，梅山和二花脸猪中B等位基因频率为1或接近1，其他7个猪种均为A等位基因频率为1；（4）在302头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，该位点与出生重、内脂率、肥肉率、胴体长、肩部背膘厚、胸腰椎间背膘厚、臀部背膘厚和肌内水分等性状差异显著，以加性作用方式为主；（5）该基因在心脏和骨骼肌中表达丰度最高，在脾脏、胃、小肠和子宫中不表达，在其余组织不同程度的表达。6、TTID （Titin Immunoglobul in Domain Protein；肌联蛋白免疫球蛋白区域蛋白）：（1）获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种基因全长cDNA序列以及除第2、7内含子外的所有内含子序列，提交到GenBank的登录号为DQ157551和DQ480148；（2）序列比对发现了51个SNPs，该基因cDNA中没有发现碱基突变或缺失；（3）建立了第6内含子T／C替换的PCR-HinfⅠ-RFLP分型方法，在检测的10个猪种中，在大白和长白猪种中B等位基因的频率为1或是接近1，国内品种中除鄂西黑猪、清平猪和八眉猪中B等位基因频率略占优势外，其余5个品种均为A等位基因占绝对优势；（4）在279头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，胴体性状方面，该位点与皮率和眼肌面积差异显著，与平均皮厚差异极显著；并且表现为加性效应显著或极显著，肉质方面，该位点与股二头肌pH值、背最长肌和肌内水分差异显著，表现为显性效应显著；（5）该基因在心脏和骨骼肌中表达量很高，在脂肪和肺中微量表达，其余组织中不表达。7、PFKM （Phosphofructokinase Muscle Type，肌型磷酸果糖激酶）：（1）获得了大白猪、长白猪、梅山猪三个猪种基因全长cDNA序列及第2到21内含子序列，验证猪中第1内含子的大小，序列GenBank的登录号为DQ363336和DQ480147；（2）序列比对发现了111处SNPs，其中4处预测可导致氨基酸改变；（3）建立了第13外显子T／C替换和第17外显子的PCR-TaqⅠ-RFLP分型方法，在所检测的7个猪种中，第13外显子多态性分布频率在检测的大白、长白和鄂西黑猪中B等位基因频率为1，另外四个国内猪种均为B等位基因占优势，在所检测的7个猪种中，第17外显子多态性分布频率基本同第13外显子位点的分布，（4）在214头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，第13外显子位点基因型不同时，出生重、内脂率、肥肉率、瘦肉率、瘦肥比率、眼肌高度、6—7胸腰椎间背膘厚、胸腰椎间背膘厚、肩部背膘厚、三点平均背膘厚、股二头肌色值、背最长肌大理石纹、肌内水分和肌内脂肪差异显著或极显著；该位点在部分胴体性状加性效应和显性效应均为极显著；在241头大×梅F2代资源家系中进行标记性状关联分析，第17外显子位点与眼肌高度、臀部背膘厚、三点平均背膘厚、大理石纹、失水率、系水力、肌内脂肪和肌内水分差异显著或极显著；（5）该基因在心脏和骨骼肌中表达量很高，胃和小肠没有表达，其他组织均有不同程度的表达。8、MYLPF （myosin light chain，phosphorylatable，fast skeletal muscle，肌浆球蛋白轻链可磷酸化蛋白）：（1）获得了大白猪、长白猪和梅山猪的基因组序列；序列GenBank的登录号为DQ533994；（2）序列比对，发现了43处SNPs，有5处cSNPs，其中3处预测可导致氨基酸改变；（3）建立了第1内含子G／A替换的PCR-TaqⅠ-RFLP和TIC替换的PCR-MspⅠ-RFLP分型方法；在所检测的7个猪种中，第1内含子MspⅠ-RFLP多态性分布频率在长白猪中A等位基因与B等位基因频率的比例大约为1：2，其余猪种为B等位基因占绝对优势；在所检测的7个猪种中，第1内含子TaqⅠ-RFLP多态性分布频率，在大白和长白猪中A等位基因与B等位基因频率的比例大约为1：2，国内猪种均为B等位基因占绝对优势；（4）在140头试验猪群（长白、梅山、长白、长白×大白、大白×长白）中进行标记性状关联分析，基因型不同时，瘦肉率、皮率、股二头肌大理石纹、背最长肌大理石纹和肌内水分差异显著，眼肌宽度、眼肌面积和肌内脂肪差异极显著，肩部背膘厚和眼肌高度差异接近显著水平；该位点在这些性状上均表现为加性作用方式，但作用方向不同；（5）该基因在各组织中均有表达，尤以心脏和骨骼肌中表达丰度最高。上述实验结果为进一步探讨这些基因对于猪肌肉生产和代谢相关性状影响的分子机制，以及应用标记辅助选择进行分子育种提供了一些有价值的依据，从而推进猪遗传改良工作的进程，为我国功能基因组的研究和源头创新奠定基础。
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