论文题目: 巴西橡胶树HbMyb1调控基因的克隆及表达
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 张云霞
导师: 陈守才
关键词: 巴西橡胶树,死皮抗性相关基因,调节基因,克隆与表达
文献来源: 华南热带农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 天然橡胶因具有很强的弹性、良好的绝缘性、可塑性、耐磨性、耐拉性、隔水隔气性等显著特点而被广泛运用于工业、农业、国防、交通运输、机械制造、医药卫生和日常生活等方面。天然橡胶不但是关系到国计民生的主要战略物资,而且是不可缺少的工业原料之一。据国际橡胶研究组织(IRSG)统计,2003年,世界各国天然橡胶的年生产量为775.0万吨,年需求量约为785.0万吨;中国天然橡胶的年生产量为56.0万吨,居世界第五位,年消费量为172.0万吨,居世界第一位。有关专家预测,至2010年,世界天然橡胶年需求量约为1000万吨,中国年需求量300—350万吨,天然橡胶供应将严重短缺。然而,由于天然橡胶产业是一种典型的资源约束型产业,具较高的地域要求,根据我国的实际情况,国家行业结构调整计划中,我国橡胶树种植面积仅定为70万公顷。若按照目前的单产水平计算,年产仅达70万吨。由此可见,国产天然橡胶的缺口还相当大。所以,提高橡胶单产已成为急中之急。 然而橡胶树“死皮病”给橡胶种植业带来严重的危害,是天然橡胶单产提高的限制因子。因此,对橡胶树“死皮病”的研究已成为世界性研究的热点问题。目前研究界把“死皮病”分为两类,一类叫“褐皮病”(Bark necrosis),病株的乳管被侵填体入侵,乳管完全被破坏,树皮完全坏死,产胶能力再也不能恢复。有人认为,这类“死皮病”可能是由病原菌引起的,但是由于始终分离不出相应病原菌,该观点不被普遍认可。该类型“死皮病”发生很少,在生产上造成损失不大,因此研究也较少。另一类叫“割面干枯病”(Tapping Panel Dryness,TPD),现在已被各国公认为由伤害(割胶)和乙烯刺激(现生产上普遍采用的增产措施)引起的复杂的生理综合症。健康的橡胶树割胶后,受膨压影响,胶乳溢流而出,均匀地沿着割线流下,通过“引子”导入胶杯中。一般经过3-8小时后,由于特定机制,乳管中的部分黄
论文目录:
摘要
Abstract
1 文献综述
1.1 橡胶树死皮病研究概况及进展
1.1.1 TPD发生机理的相关研究
1.1.2 TPD发生机理的相关假说
1.2 高等植物程序性细胞死亡研究进展
1.2.1 植物正常发育过程中的PCD
1.2.1.1 微管(TE)分化过程中发生的PCD
1.2.1.2 胚发育过程中的PCD
1.2.1.3 性别分化过程中的PCD
1.2.1.4 植物衰老过程中发生的PCD
1.2.1.5 植物发育性PCD的生物学意义
1.2.2 环境胁迫诱导的植物程序性细胞死亡
1.2.2.1 环境胁迫因子的类型
1.2.2.2 环境胁迫诱导的植物PCD重要信号分子
1.2.2.3 环境胁迫因子诱发的PCD的生物学意义
1.3 植物Myb类转录因子研究进展
1.3.1 Myb蛋白的结构及分类
1.3.2 植物Myb蛋白的生物学功能
1.3.3 植物Myb蛋白的表达调控
1.4 基因表达调控中的DNA结合蛋白及其研究方法
1.4.1 DNA结合蛋白
1.4.2 DNA结合蛋白的研究方法
1.4.2.1 体外研究方法
1.4.2.2 酵母单杂交技术
2.本研究的目的意义
3.本研究的技术路线
4.材料与方法
4.1 HbMyb1启动子的克隆
4.1.1 CTAB法提取橡胶树基因组DNA
4.1.2 HbMyb1启动子的PCR扩增
4.1.3 PCR产物的凝胶回收
4.1.4 PCR产物双酶切
4.1.5 酶切产物的凝胶回收
4.2 酵母单杂交技术筛选与HbMyb1启动子(P)结合的基因
4.2.1 诱饵载体与P的重组
4.2.1.1 空诱饵载体pHIS2的双酶切
4.2.1.2 pHIS2与P的连接
4.2.1.3 连接液转化大肠杆菌DH5a感受态细胞
4.2.1.4 重组子的鉴定
4.2.1.5 重组质粒的大量提取和纯化
4.2.1.6 单杂交诱饵载体的序列鉴定
4.2.2.对重组诱饵载体pHIS2/P进行组氨酸本底表达水平的测定
4.2.2.1 酵母(Y187)菌株感受态细胞的小量制备
4.2.2.2 重组诱饵载体转化酵母感受态细胞
4.2.3 胶乳cDNA文库的构建
4.2.3.1 胶乳总RNA的提取
4.2.3.2.以Oligo(dT)为引物合成cDNA第一链
4.2.3.3 LD-PCR扩增双链cDNA片段
4.2.3.4 双链cDNA的纯化
4.2.4 酵母单杂交文库的筛选
4.2.4.1 大量制备酵母(Y187)感受态细胞
4.2.4.2 三元共转化筛选
4.2.5.阳性克隆的分析
4.2.5.1 阳性克隆的表型验证
4.2.5.2 阳性克隆的进一步分析
4.3 HbMyb1调节基因(Hb2)的表达分析
4.3.1 橡胶树胶乳总RNA的提取
4.3.2 橡胶树叶片和胶乳总RNA的电泳
4.3.3 RNA凝胶印迹转移
4.3.4 探针的标记
4.3.5 预杂交和杂交
4.3.6 杂交后洗膜
4.3.7 免疫检测
4.4 基因Hb2与HbMyb1启动子相互作用的验证研究
4.4.1 HbMyb1启动子控制的植物表达载体的构建
4.4.1.1 启动子序列的扩增
4.4.1.2.目的片段的双酶切
4.4.1.3.启动子区段与载体的连接
4.4.1.4 连接产物转化大肠杆菌
4.4.1.5 质粒的小量提取及阳性菌落的PCR鉴定
4.4.1.6 阳性质粒的大量提取
4.4.2 胶乳离体表达系统研究Hb2与启动子之间的相互作用
4.4.2.1 胶乳离体表达系统的制备
4.4.2.2 Hb2与HbMyb1启动子之间相互作用的验证
5 结果与分析
5.1 HbMyb1启动子的克隆
5.2 HbMyb1调节子编码基因的克隆
5.2.1 诱饵载体pHIS2/P的构建
5.2.2 对重组诱饵载体进行组氨酸本底表达水平的测定结果
5.2.3 胶乳cDNA文库的构建结果与分析
5.2.4 酵母单杂交文库的筛选结果与分析
5.2.5 Hb2的序列分析
5.3 Hb2的表达分析
5.4 Hb2与HbMyb1相互作用的体外验证结果与分析
5.4.1 启动子缺失植物表达载体的构建结果与分析
5.4.2 Hb2与HbMyb1调节关系的鉴定
6 讨论
7 结论
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2005-07-27
参考文献
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标签：巴西橡胶树论文; 死皮抗性相关基因论文; 调节基因论文; 克隆与表达论文;