防治Alzheimer病药物作用候选基因靶标的初步验证

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）是一种严重危害人类健康的神经退行性疾病。由于其发病机制复杂,迄今尚不十分清楚,亦无理想的治疗药物问世,因此,给其防治带来了很大的困难,近期很难取得突破性进展。目前临床用于治疗AD的主要药物如胆碱酯酶抑制剂只能减轻部分症状,对患者脑内的主要病理变化并无明显改善作用,也不能延缓病程或控制病情的发展。因此,研究开发疗效好、毒副作用小的新型防治AD药物变得极为迫切。创新药物研究和开发中最重要的环节之一就是药物靶标的发现。AD是典型的多基因复杂疾病,其发生发展过程涉及多系统、多环节结构和功能的异常,因此,针对单一靶点的防治策略和措施难以取得满意疗效,多靶点综合干预才是提高AD防治水平的重要策略。因此,寻找并确立一组或几组与AD脑内病理改变及认知功能障碍密切相关的、相互之间具有补充与协同关系的“组合靶标”,将为AD防治药物的筛选和发现提供新的筛选靶标体系,将大大提高AD防治药物的研究和开发水平。中药复方具有通过多途径、多环节和多靶点发挥作用的特点,因此其在防治AD这类多基因复杂疾病方面,与作用靶点相对单一的化学药物相比,具有明显的优势和特色。我国和日本等国家在防治AD中广泛使用的中药复方如六味地黄汤（Liu-Wei-Di-Huang decoction,LW）、八味地黄汤（Ba-Wei-Di-Huang decoction,BW）、黄连解毒汤（Huang-Lian-Jie-Du decoction,HL）、当归芍药散（Dang-Gui-Shao-Yao-San,DSS）、调心方（Tiao-Xin-Fang decoction,TXF）等,不但在治疗AD中取得了良好的临床疗效,而且在实验药理学研究中也被证明对于AD模型动物或学习记忆功能障碍模型动物具有良好治疗作用。从中医药分类看,这些中药复方的功能主治不尽相同,如补肾、活血化瘀、清热解毒等,提示它们发挥药效的靶点和作用机理可能有所不同,但对AD病人或模型动物具有良好疗效是其共同特点。因此,从这些中药中选择几种疗效明确的代表方剂做为工具,研究和探索它们发挥益智作用的环节或靶点有望为防治AD药物筛选与研究新靶标的发现提供线索,同时还可能为从药理学角度研究和阐述AD的病理生理学过程和发病机制提供新的线索。基于上述原因,本实验室在国家重点基础研究发展规划（973）项目的资助下,选择包括六味地黄汤、八味地黄汤、当归芍药散、调心方及黄连解毒汤在内的几种功能主治不同的中药复方作为工具药物,以与AD具有相似病理特点的快速老化模型小鼠（senescence-accelerated mouse,SAM）P8亚系（SAMP8）为模型,通过实验治疗并结合抑制消减杂交、基因芯片和蛋白质组学等技术,从与学习记忆或认知功能密切相关的脑区,即海马和大脑皮层,寻找药物反应基因和蛋白,并通过系统的分析与比较,初步提出了一组可能用于AD防治药物筛选和评价的候选“组合基因靶标”。本课题在上述研究的基础上进行,重点在于对上述所提出的“组合基因靶标”进行初步验证。本研究主要从所提出的“组合基因靶标”中选择了2个与AD病理变化密切相关的分子APP和Tau,和5类9个具有其它功能代表性的基因进行研究,其中包括与异常蛋白降解相关的分子AMFR和STUB1、细胞骨架相关分子NF-L、线粒体功能相关分子NDUFS2、信号转导相关分子CAMK2A、EphB6、CSTN1以及神经发生生长相关分子NRXN1、NGRN基因等。主要开展了以下几方面工作:首先观察了所选基因及其蛋白在SAMP8及其正常对照SAM R1亚系（SAMR1）海马和皮层中的增龄性表达和分布变化,进而观察了防治AD有效的5种中药复方LW、BW、HL、DSS、TXF以及1种天然产物石杉碱甲（Hupzine A,HupA）对这些基因及其蛋白表达的影响,最后,采用生物信息学方法对所选基因之间的相互关系及其与已知的几种AD关键病理分子之间的可能关系等进行了分析。一、AD关键病理分子APP和tau蛋白表达的动态变化及其对防治AD药物的反应β淀粉样蛋白（βamyloid protein,Aβ）沉积形成老年斑（senile plaques,SP）、tau蛋白异常聚集形成神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFT）和神经元丢失是AD的主要病理学特征,其中,Aβ和tau蛋白被认为是AD形成和发展的关键因素。因此本研究首先对实验所采用的与AD具有相似病理学特征的模型动物SAMP8海马和皮层中β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）和tau蛋白的表达情况进行了探讨。1.快速老化模型小鼠增龄过程中APP表达的动态变化及其对防治AD药物的反应采用实时定量PCR技术,观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层APP mRNA表达的变化。结果表明,增龄过程中,SAMR1海马和皮层中APP mRNA的表达维持在相对恒定水平,而SAMP8中的表达随增龄逐渐增加,其中,12月龄时的表达水平显著高于2月龄和6月龄。与同龄SAMR1相比,6和12月龄SAMP8皮层中、12月龄SAMP8海马中APP表达水平均显著升高。上述结果提示SAMP8海马和皮层中APP mRNA表达水平随增龄明显增高,这可能是其学习记忆功能随增龄进行性衰退的重要原因。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,除BW外,其余药物均能不同程度地纠正或逆转SAMP8皮层中APP mRNA表达的升高;BW和DSS能逆转海马中其表达的升高。表明所选中药复方和天然药物对SAMP8APP基因的异常表达具有不同程度的改善或纠正作用,提示APP基因对所选的防治AD药物具有明显反应性。2.快速老化模型小鼠增龄过程中tau蛋白表达的动态变化及其对防治AD药物的反应观察SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层中tau蛋白mRNA表达变化的结果表明,增龄过程中,SAMR1皮层中tau蛋白mRNA的表达无明显变化,而SAMP8皮层中其表达随增龄增加,12月龄时表达水平最高,且显著高于同龄SAMR1。在海马中,tau蛋白mRNA的表达虽然在二亚系动物中均随增龄进行性增高,但在各月龄SAMP8中,其表达水平均明显高于同龄SAMR1。提示tau蛋白基因表达水平的增高可能也是SAMP8学习记忆功能衰退的重要原因之一。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,均明显下调SAMP8皮层tau蛋白基因表达的升高;而在海马中,只有HL未表现出对该基因表达的下调作用,其余药物均表现出对其的下调作用。表明所选药物对SAMP8tau蛋白mRNA的异常表达具有不同程度的改善作用,提示tau蛋白基因对所选防治AD药物亦具有明显反应性。结合文献和我们以往的研究结果,可以认为,APP与tau的表达随增龄在SAMP8海马和皮层中的进行性增高可能是SAMP8学习记忆功能进行性衰退的重要原因,药物对其表达异常的改善或纠正正是药物改善其认知功能的重要原因。上述研究结果进一步说明SAMP8是一个可用于AD发生机理和药物筛选的良好动物模型,从而为我们选择此模型开展防治AD药物作用候选“组合基因靶标”的验证提供了新的实验依据。二、AMFR等9个候选基因表达的动态变化及其对防治AD药物的反应（一）与异常蛋白降解相关的分子AMFR和STUB11.AMFRAMFR（Autocrine motility factor receptor,自分泌运动因子受体）是一个G-蛋白偶联受体,具有E3泛素-蛋白连接酶活性,参与滑面型内质网介导的异常蛋白的降解,AMFR与其配体AMF结合后,能够产生刺激细胞运动、促进神经元的生长与存活等作用。为了研究AMFR是否参与AD的发病,本研究观察了随增龄,AMFR及其配体AMF在SAM脑中的表达以及AMFR对防治AD药物的反应。1.1快速老化模型小鼠增龄过程中AMFR及其配体表达的动态变化采用实时定量PCR技术,观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层AMFR mRNA表达的变化。结果表明,增龄过程中,在SAMR1的皮层和海马中,AMFR表达水平在2月龄最低,在6月龄最高;而在SAMP8的上述脑区,其表达于12月龄时达最低水平,且显著低于同龄SAMR1。进而,采用Western blot技术,观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层中AMFR蛋白表达的变化。结果表明,SAMR1皮层和海马中AMFR蛋白的表达随增龄显著增加,6月龄时已基本达表达高峰,此后基本无显著变化;而在SAMP8中,其表达则随增龄显著下降,至15月龄降至最低。与同龄SAMR1比较,2月龄,即幼龄时,SAMP8海马和皮层中AMFR的表达均显著增高,而15月龄,即老龄时,SAMP8中其表达则显著降低。由于AMFR具有参与内质网介导的异常蛋白降解的功能,因此,我们推测,老龄SAMP8脑中包括Aβ在内的异常蛋白沉积的增多可能与AMFR表达水平的降低有关。AMF（Autocrine motility factor,自分泌运动因子）是AMFR的配体,具有神经营养作用。接下来,又观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层该蛋白表达的变化。结果表明,在SAMR1皮层中,AMF蛋白在10、15月龄的表达较2、6月龄显著增加;而在SAMP8皮层中,其表达在6月龄最高,其后随增龄逐渐降低,至15月龄降至最低。两亚系之间比较的结果表明,除6月龄外,各月龄SAMP8皮层中AMF的表达均显著低于同龄SAMR1。在海马中,该蛋白的表达在各月龄SAMR1间无显著差别,而在SAMP8中,其表达于10月龄时最高,于2月龄时最低。两亚系之间进行比较发现,该蛋白在各月龄SAMP8海马中的表达也显著低于同龄SAMR1。结果提示,AMF水平的显著低下可能也是SAMP8表现有增龄性脑神经病理损害和认知功能障碍的重要原因。1.2防治AD药物对AMFR表达的影响分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,LW和HupA显著上调SAMP8皮层中AMFR mRNA异常低表达;而在海马中,该基因表达的降低可被除LW之外的所有受试药物显著上调。进一步观察上述药物对AMFR蛋白表达影响的结果表明,无论在皮层还是海马中,LW、BW、HupA均对SAMP8AMFR蛋白表达的降低显示出了显著的上调作用。上述结果表明所选药物对SAMP8 AMFR基因和蛋白的异常表达具有不同程度的改善作用,提示AMFR对所选防治AD药物具有明显反应性。2.STUB1STUB1（STIP1 homology and U-Box containing protein 1,STIP1同源和U-Box域包含蛋白）兼有辅助分子伴侣功能和E3泛素-蛋白连接酶活性,是异常蛋白降解的泛素-蛋白酶系统和溶酶体系统二者间转换的分子开关,能够协调细胞内蛋白质量控制系统的平衡和稳定,在蛋白质量控制中起关键作用。2.1快速老化模型小鼠增龄过程中STUB1表达的动态变化分别采用实时定量PCR和Western blot技术,观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层STUB1 mRNA和蛋白表达的变化。结果表明,增龄过程中,SAMR1皮层和海马中STUB1 mRNA表达均随增龄进行性增加,12月龄时表达最高;而在SAMP8中,其在皮层和海马中的表达规律有所不同,其中,在皮层中的表达为2月龄时最高,在海马中,则为6月龄时表达最高。两亚系之间比较的结果表明,2月龄SAMP8皮层中STUB1表达水平明显高于同龄SAMR1,12月龄SAMP8皮层和海马中STUB1 mRNA表达水平均明显低于同龄SAMR1。STUB1蛋白表达的增龄性变化的趋势与mRNA基本一致。上述结果提示老龄SAMP8STUB1表达水平的低下可能造成该蛋白参与的异常蛋白降解功能降低,从而使其蛋白质量控制作用下降,这可能与文献报道的异常蛋白在老龄SAMP8中的累积有关。2.2防治AD药物对STUB1表达的影响分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,观察药物对STUB1基因表达的影响,结果表明,皮层中除TXF外,海马中除DSS外的其余5个药物均对SAMP8 STUB1 mRNA表达水平的低下表现出了明显的上调作用。观察药物对STUB1蛋白表达的影响,结果表明,皮层中除LW外,海马中除LW和HupA外,其它药物均显著上调了SAMP8中STUB1蛋白的异常低表达。结果表明所选药物对SAMP8 STUB1基因和蛋白的异常表达具有不同程度的改善作用,说明STUB1对所选防治AD药物具有明显反应性。（二）细胞骨架相关分子NF-L神经微丝是神经元特有的微丝蛋白,NF-L（Neurofilament protein,light chain,神经丝蛋白-轻链）是神经微丝三联体蛋白的聚合骨架,可通过调节神经生长、轴突管径以及轴突转运,来维持和调节着神经元细胞骨架的可塑性,在神经系统正常发育和正常发挥其功能中具有重要作用。1.快速老化模型小鼠增龄过程中NF-L表达的动态变化采用实时定量PCR和Western blot技术,观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层NF-L mRNA和蛋白表达的变化。结果表明,增龄过程中,SAMR1皮层中,NF-L mRNA和蛋白表达均维持在相对恒定的水平:而海马中,其表达均在6月龄最高;与SAMR1相比较,10月龄后SAMP8皮层和海马中NF-L基因和蛋白表达均显著减少。上述结果提示NF-L的异常低表达可能造成神经元细胞骨架受损,而诱发神经元丢失。2.防治AD药物对NF-L表达的影响分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,除LW和BW外,其余药物均能够显著上调12月龄SAMP8皮层中NF-L基因和蛋白的异常低表达;而海马中,各给药组对SAMP8中NF-L基因和蛋白的异常低表达均有上调效应。表明所选药物对SAMP8 NF-L的异常表达具有不同程度的改善作用,提示调节NF-L表达,改善由于其下降导致的神经元骨架受损而保护神经元可能是上述防治AD药物发挥AD治疗作用的共有机制之一。（三）线粒体相关分子NDUFS2NDUFS2（NADH dehydrogenase（ubiquinone）Fe-S protein 2,还原型烟酰胺二核苷酸脱氢酶铁硫蛋白2）是线粒体复合体Ⅰ铁硫蛋白的一个亚基,具有氧化还原酶活性,参与能量代谢通路,可以反映出机体的氧化磷酸化水平。采用实时定量PCR技术,观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层NDUFS2 mRNA表达的变化。结果表明,SAMR1中,NDUFS2 mRNA的表达均为6月龄最高,而2月龄最低;而SAMP8中,该基因的表达均在6月龄最低;与SAMR1相比较,SAMP8中,NDUFS2表达均在2月龄显著增加,而6月龄则显著减少。表明SAMP8早期就存在氧化磷酸化功能的异常。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,所有药物均能显著下调12月龄SAMP8皮层中NDUFS2 mRNA的异常高表达;而海马中,除LW和HupA外,其余四种药物对SAMP8中海马中NDUFS2 mRNA的异常低表达均有上调作用。提示上述防治AD有效的药物能够调节NDUFS2的异常表达从而改善SAMP8中的氧化磷酸化异常,这可能是这些防治AD药物发挥AD防治作用的共有途径之一。（四）信号转导相关分子CAMK2,EphB6和CSTN11.CAMK2ACaMKⅡ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinase typeⅡ,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ型α亚基）在神经递质释放、神经突触可塑性、学习和记忆等方面发挥着重要作用。其α亚基即CAMK2A（CaMKⅡalpha chain,CAMK2α）是CaMKⅡ在大脑皮层和海马中表达最为丰富的一个亚基,它不仅参与了tau蛋白的磷酸化,而且也可能参与了APP的磷酸化,在AD的发病过程中发挥重要作用。观察SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层CAMK2A表达变化的结果表明,增龄过程中,在SAMR1皮层和海马中,CAMK2A基因和蛋白均呈现出递减的趋势;而SAMP8中,其表达则均呈现出递增的趋势;SAMP8与SAMR1相比,10月龄后SAMP8中CAMK2A的表达均显著增加。结果提示CAMK2A表达的增龄性降低可能是导致SAMR1正常老化过程中学习记忆功能衰退的原因;而其表达的异常增加则可能导致SAMP8加速老化过程中学习记忆功能衰退。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,所有药物均能够显著下调12月龄SAMP8皮层和海马中CAMK2A mRNA的异常高表达。除LW外,上述药物均能显著下调12月龄SAMP8皮层中该蛋白的异常高表达;而在海马中,除HL和DSS外,上述药物对SAMP8中该蛋白的异常高表达也具有显著的下调作用。提示上述防治AD药物能够调节CAMK2A的异常表达从而改善SAMP8中的认知功能障碍,这也可能是六种药物改善SAMP8学习记忆功能的共同机制之一。2.EphB6EphB6（erythropoietin-producing hepatocyte receptor,促红细胞生成素源肝细胞受体B6）是一种跨膜受体蛋白,归属于酪氨酸激酶,具有独特的双向信号转导系统,能通过调节细胞骨架而发挥重要的生物学功能,在某些细胞株上其家族蛋白可调节Tau蛋白的磷酸化。观察SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层EphB6表达的变化,结果表明,增龄过程中,SAMR1 EphB6 mRNA和蛋白表达均在6-10月间最高;而SAMP8中,其表达则在10月龄后最高;SAMP8与SAMR1相比较,10月龄后其表达均显著升高。结果提示EphB6早期的异常低表达可能造成了SAMP8的细胞免疫功能的缺陷,而后期其表达的异常增加则可能是加速了SAMP8的异常老化。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,LW、HL、TXF和DSS显著下调12月龄SAMP8皮层中该基因的异常高表达;而LW、BW、TXF和DSS则能够下调12月龄SAMP8海马中该基因的异常高表达。提示上述防治AD药物能够通过调节EphB6的异常表达而起到一定防治AD作用,但如早期给药,可能会收到更好效果。3.CSTN1CSTN1（Calsyntenin-1,钙同线蛋白-1）是一个能够将胞外蛋白水解活性与胞内Ca2+信号转导相关联的独特的突触后膜蛋白,能与钙离子结合,参与信号转导和细胞交流,能通过胞外蛋白水解来调节突触后钙的动力,同时,APP和CSTN1共同作用可增加Aβ的分泌,在AD的发生过程中发挥作用。观察SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层CSTN1 mRNA表达变化的结果表明,增龄过程中,SAMR1 CSTN1 mRNA表达均在6月龄最高,2月龄最低;而在SAMP8中,其表达则有增龄性增加的趋势,其中以皮层的变化较为显著;与SAMR1相比,其表达在12月龄SAMP8中均显著增加。结果提示CSTN1的异常高表达可能造成SAMP8中Aβ释放的增加,从而加速AD的进程。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和HupA一个月,LW、BW、HL和DSS显著下调12月龄SAMP8皮层中该基因的异常高表达;而BW、HL、DSS和HupA也能够显著下调12月龄SAMP8海马中该基因的异常高表达。提示上述防治AD药物可能通过调节CSTN1的异常表达而减少Aβ的释放,起到一定的防治AD作用。（五）神经发生生长相关分子Neurexin1和NGRN1.Neurexin 1NeurexinⅠ（Neurexin蛋白-1）可作为突触后受体与黑寡妇蜘蛛毒素α-latrotoxin结合,激发神经递质的释放,可作为细胞黏附分子和受体而发挥其作用,并与突触发生紧密相关。本研究还观察了SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层NRXN1的mRNA表达的变化。结果表明,增龄过程中,SAMR1中,NRXN1 mRNA的表达在皮层中在6月龄最低,而海马中则在6月龄最高;在SAMP8中,其在皮层中增龄性递减,而在海马的表达则维持在不变的低水平;与SAMR1相比,其表达均在12月龄SAMP8中显著减少。结果提示NRXN1的异常表达可能造成SAMP8中细胞的营养不良环境,从而加速AD的进程。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,除LW、HL外的其它药物均显著上调12月龄SAMP8皮层中该基因的异常低表达;同样,除LW外的其它药物均显著上调12月龄SAMP8海马该基因的异常低表达。提示上述防治AD药物能够通过上调NRXN1的异常低表达而部分改善SAMP8神经细胞的营养环境而发挥一定AD防治作用。2.NGRNNGRN（Neurite outgrowth associated protein,神经突生长相关蛋白）可能与细胞生长和维持有关,并可能在神经元分化过程中起重要作用。观察SAMP8和SAMR1增龄过程中海马和皮层NGRN的mRNA表达变化的结果表明,增龄过程中,SAMR1中,NGRN mRNA的表达在皮层随增龄递减,在海马中则相反;在SAMP8中,其在皮层和海马的表达均为6月龄最低;与SAMR1相比,其在6月龄SAMP8的皮层和12月龄的海马中均显著减少。结果提示NGRN的异常表达可能造成SAMP8中细胞的营养不良环境,从而加速AD的进程。分别灌胃给予SAMP8 LW、BW、HL、DSS、TXF和Hup A一个月,LW、HL、DSS和HupA显著上调SAMP8中该基因的异常低水平,而海马中,除TXF外,其它药物对SAMP8中该基因的异常低水平表达也均有上调效应。提示上述防治AD药物能够通过上调NRXN1的异常低表达而部分改善SAMP8神经细胞的营养环境而发挥一定的抗AD作用。三、候选分子AMFR等与AD关键病理蛋白的关系研究1.AD关键病理蛋白在快速老化模型小鼠脑中的组织分布变化用免疫组织化学的方法研究了AD关键病理蛋白APP、Tau和P-Tau在SAM鼠脑中的组织分布变化,结果表明,随SAMP8增龄,这三种AD关键病理蛋白在海马齿状回、海马CA3区以及颞叶皮层中均呈现出表达增加的趋势。2.AMFR在快速老化模型小鼠脑中的组织分布变化用免疫组织化学的方法研究了AMFR蛋白在SAM鼠脑中的组织分布变化,结果表明,随SAMP8增龄,AMFR蛋白在海马齿状回、海马CA3区以及颞叶皮层中均呈现出表达减少的趋势。3.AMFR、STUB1与APP在快速老化模型小鼠额叶皮层的共定位免疫荧光共定位研究结果显示:AMFR、STUB1与APP能够共表达于SAMP8的额叶皮层,在6月龄的SAMP8小鼠大脑的额叶皮层,AMFR与APP、STUB1与APP存在共定位关系。四、候选基因靶标间的相互关系及其与AD关键病理分子关系的生物信息学分析采用Osprey软件,首先考察了能够与AD关键病理蛋白及能够与所选9个分子直接相互作用的分子情况,结果表明,能够与APP发生直接相互作用的分子共49个;能够与Tau发生直接相互作用的分子共16个;能够与AMFR和STUB1发生直接相互作用的分别有3个和8个分子;能够与NF-L发生直接相互作用的分子共4个;未发现与NDUFS2和NGRN直接作用的分子;能够与CAMK2A、EphB6和CSTN1发生直接相互作用的分子分别为14个、4个和3个。其次,分析了所选9个分子间及他们与APP、Tau、PS1、PS2和ApoE的直接相互作用。结果表明,所选9个分子间不存在直接的相互作用;只有CSTN1可以和APP、PS1发生直接相互作用,而其余分子间则不发生直接作用。最后,分析了所选9个分子及与之相互作用的分子和AD关键病理分子的可能关系,预测结果表明它们中的80%能够与AD关键病理分子APP、Tau发生间接相互作用,而且是通过多条通路。其中,AMFR可以通过EphB6与APP、Tau发生联系;STUB1、EphB6、NRXN1均能与APP、Tau发生联系;NF-L与Tau联系密切,但同时也能够与APP发生联系;CaMK2A与APP关系较近,但也可以通过APP与Tau发生联系。结果提示从候选“组合基因靶标”中所选的各分子不是孤立在发挥作用,而是与AD关键病理蛋白形成相互作用网络来参与AD的病理生理过程。这一结果支持我们的假说,即它们不是单个基因的作用,而是形成一个作用网络,来参与AD的病理。上述结果表明,从候选“组合基因靶标”中选择的5类9个分别代表不同功能的分子在SAMP8海马和皮层中的表达水平随增龄出现不同程度的异常,尤其在老龄SAMP8中表达异常最为明显,抗AD有效药物对其异常表达具有改善或纠正作用。同时,研究还表明,AMFR和STUB1在海马和皮层中与AD关键病理分子之一APP存在共定位关系,提示其可能对APP代谢生成Aβ产生影响。生物信息学分析提示所选的候选基因及其蛋白可通过多种途径与AD关键病理分子发生相互作用,从而发挥干预AD病理生理过程及改善认知功能的作用。上述研究结果提示,所选9个候选基因及其蛋白表达的异常可能是SAMP8随增龄脑内出现多种神经病理损害,并导致其学习记忆功能进行性衰退的重要原因,改善这些基因和蛋白的异常表达可能是降低AD相关神经病理损害、改善认知功能障碍的重要途径。因此,上述这9个分子有成为抗AD药物筛选潜在靶标的可能,有待进一步深入研究。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 结果
• 第一部分 AD关键病理分子APP和TAU蛋白表达的动态变化及其对防治AD药物的反应
• 一、快速老化模型小鼠增龄过程中APP表达的动态变化及其对鲂治AD药物的反应
• 二、快速老化模型小鼠增龄过程中tau表达的动态及变化其对防治AD药物的反应
• 第二部分 AMFR等9个候选基因表达的动态变化及其对防治AD药物的反应
• 一、与异常蛋白降解相关的分子AMFR和STUB1
• 二、细胞骨架相关分子NF-L
• 三、线粒体相关分子NDUFS2
• 四、信号转导相关分子CAMK2A、EphB6和CSTN1
• 五、神经发生生长相关分子NRXN1和NGRN
• 第三部分 AMFR等候选基因与AD关键病理分子表达关系的研究
• 一、AD关键病理蛋白APP、Tau、、p-Tau的增龄性组织分布
• 二、AMFR在SAM鼠中的增龄性组织分布
• 三、AMFR、STUB1与APP在SAM脑中的免疫荧光共定位研究
• 第四部分 候选基因靶标间的相互关系及其在AD中的作用研究
• 一、与AD关键病理蛋白及与各候选基因药物靶标直接相互作用分子的研究
• 二、各候选基因药物靶标间的直接相互作用研究
• 三、各候选基因药物靶标与AD关键病理蛋白的可能相互关系研究
• 讨论
• 第一部分 SAMPS是防治AD药物候选基因靶标验证的有效模型。
• 第二部分 SAMSP海马和皮层中候选基因靶标的初步验证
• 第三部分 候选分子AMFR等与AD关键病理蛋白的关系研究
• 第四部分 防治AD药物候选基因靶标之间的相互关系研究
• 结论
• 参考文献
• 研究论文
• 文献综述
• 个人简历
• 致谢