茶尺蠖小RNA病毒基因组结构分析

论文题目: 茶尺蠖小RNA病毒基因组结构分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 王小纯

导师: 胡远扬

关键词: 茶尺蠖,小病毒,理化性质,序列测定,基因组结构

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 茶尺蠖是危害茶叶生产的主要害虫,本研究室于2000年首次从NPV感染致死的茶尺蠖幼虫中发现了直径为26nm的球状病毒。采用差异离心和蔗糖密度梯度离心法,首次从NPV感染致死的茶尺蠖幼虫中分离纯化了一株小RNA病毒。将病毒液涂在新鲜茶叶上饲喂茶尺蠖幼虫,幼虫在第三天开始出现症状:厌食、停止活动并开始萎缩,大约五天内死亡。从虫尸中分离到形状与大小相同的病毒,我们称之为茶尺蠖小RNA病毒(Evtropis oblique picorna-like virus,EoPV)。 透射电镜观察纯化的EoPV病毒粒子为无囊膜、无表面特征、直径约26nm的球状颗粒。16%的SDS-PAGE电泳显示它有两个分子量分别为31.5和28.8kD的衣壳蛋白,后者的含量是前者的2.5倍。基因组是ssRNA,长大约9,400nt。 为了进一步确定EoPV在病毒分类中的地位,采用引物延伸、RT—PCR和5′RACE技术,建立了一系列EoPV末端重叠的克隆,测定了基因组核苷酸序列。除polyA外,EoPV基因组全长9394nt(GeneBank No.AY365024)。A和T含量丰富,占55.46%。符合小RNA病毒的特点。EoPV基因组含一个大的开放阅读框,编码2987个氨基酸,从391nt开始,在9351nt处结束于密码子UAA。 通过对EoPV的5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现EoPV具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多的特点。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物小RNA病毒内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。与登陆GeneBank的14株昆虫小RNA病毒及哺乳动物小RNA病毒的非编码区比较表明:EoPV的5′UTR比昆虫小RNA病毒和哺乳动物小RNA病毒的短。3′UTR与哺乳动物小RNA病毒相似,较短,没有加尾信号。 EoPV基因组含一个大的开放阅读框nt391-9351,编码含2987个氨基酸的多肽。与其它病毒蛋白的序列比对分析发现在基因组3′部分含有小RNA病毒的RNA解旋酶、蛋白酶和依赖于RNA的RNA复制酶的保守序列,依次沿5′到3′方向排列。所有

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 绪论

1.1 昆虫病毒

1.1.1 昆虫病毒分类

1.1.2 昆虫病毒分子生物学

1.1.3 昆虫病毒研究的意义

1.2 昆虫单链RNA病毒分类现状

1.3 小RNA病毒的分类特征

1.4 哺乳动物小RNA病毒基因组结构

1.4.1 5′非编码区

1.4.2 结构蛋白

1.4.3 非结构蛋白

1.4.4 3′非编码区

1.5 小RNA病毒的复制过程

1.5.1 受体识别

1.5.2 脱壳

1.5.3 翻译

1.5.4 基因组复制

1.5.5 组装、成熟与释放

1.6 昆虫小RNA病毒研究进展

1.6.1 昆虫小RNA病毒的理化特征

1.6.2 昆虫小RNA病毒的基因组结构

1.6.3 昆虫小RNA病毒蛋白质翻译

1.6.4 昆虫小RNA病毒与其它小RNA病毒的进化关系

1.7 研究茶尺蠖小RNA病毒的意义

第二章 茶尺蠖小RNA病毒的发现及分离鉴定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 病毒及其宿主

2.2.2 病毒的分离纯化

2.2.3 病毒粒子的电镜检查

2.2.4 病毒的感染与收获

2.3 结果与分析

2.3.1 茶尺蠖小RNA病毒的分离纯化及电镜分析

2.3.1 茶尺蠖小RNA病毒感染茶尺蠖的症状

2.4 讨论

第三章 茶尺蠖小RNA病毒理化性质鉴定

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 工具酶

3.2.3 主要化学药品和溶液

3.2.4 DNA分子量参照物

3.2.5 仪器

3.2.6 常规分子生物学实验方法

3.2.7 病毒的分离纯化

3.2.8 病毒结构蛋白分析(SDS—PAGE)

3.2.9 病毒核酸的提取(Trizol kit)

3.2.10 RNA的甲醛凝胶变性电泳药品、试剂及溶液

3.2.11 病毒核酸性质的鉴定

3.3 结果与分析

3.3.1 茶尺蠖小RNA病毒的结构蛋白

3.3.2 茶尺蠖小RNA病毒核酸的性质

3.3.3 EoPV 3’端克隆与序列分析

3.4 讨论

第四章 EoPV全基因组核苷酸序列测定

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 方法

4.3 结果与分析

4.3.1 cDNA片段的克隆及重组质粒的酶切鉴定

4.3.2 5′RACE克隆与酶切鉴定

4.3.3 EoPV基因组核苷酸序列

4.3.4 讨论

第五章 EoPV基因组结构分析

5.1 引言

5.2 EoPV与其它小RNA病毒非编码区比较分析

5.2.1 引言

5.2.2 材料与方法

5.2.3 结果与分析

5.2.4 讨论

5.3 EoPV编码区序列分析

5.3.1引言

5.3.2 材料与方法

5.3.3 结果与分析

5.3.4 讨论

研究总结

参考文献

博士在读期间发表和待发表的文章

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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