假单胞菌喹诺酮信号系统抑制剂的筛选与研究

论文摘要

临床细菌的耐药性成为医学研究领域的重大课题。随着科学研究的深入,细菌的群体感应（quorum sensing, QS）现象被发现并逐渐阐明,其对细菌感染能力具有重要作用。通过抑制细菌群体感应调控系统可以有效降低细菌的感染能力,并且不会对细菌的生长产生威胁,从而避免细菌产生耐药性。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会致病菌,对肺囊性纤维化等免疫缺陷型病人感染率很高。喹诺酮信号系统（Pseudomonas quinolone signal system, pqs）是铜绿假单胞菌群体感应调控网络重要组成部分,其相关信号分子是细菌种间交流的媒介,但目前对该系统研究相对较少。本文构建了针对铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统的抑制剂筛选模型体系,目的是从中药粗提物中筛选得到较好的群体感应抑制剂,为开发新型抗菌药物奠定基础。本文构建了针对铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统的抑制剂筛选菌株PQSI1,其由野生型铜绿假单胞菌PAOI与质粒pPQSI1构成。质粒pPQSI1由长度344bp的PpqsA启动子及蔗糖致死基因（sacB）组成。基因组表达的调控蛋白PqsR与信号分子PQS形成的活性复合物可以启动sacB基因表达,导致细菌死亡；在群体感应抑制剂存在条件下,sacB基因不能表达,细菌无蔗糖致死现象。通过测定细菌密度来表征化合物的群体感应抑制活性,菌液密度越高则化合物抑制活性越大。这种液体筛选体系具有经济及操作简便的特点,可用于高通量筛选群体感应抑制物。由于筛选得到的抑制物通常为粗提物,所以本文同时构建了可以追踪抑制剂的菌株PQSI2。模型质粒pPQSI2由长度为493bp的PpqsA启动子及下游sacB基因组成。利用薄层层析技术将阳性粗提物中化合物进行分离,将混有PQSI2菌液的固体培养基铺在薄层板表面培养。通过直接观察活细菌位置可以判定群体感应抑制剂在薄层板上的位点。这种生物自显影技术具有直观性的特点。本实验将高通量筛选模型PQSI1与生物自显影模型PQSI2相结合,形成了一套有效获得群体感应抑制剂的模型体系。本文利用高通量液体筛选模型PQSI1对50多种中药提取物进行群体感应抑制活性检测,发现羌活、厚朴及大叶紫珠等10种中药粗提物的抑制活性较好,其中羌活群体感应抑制活性最佳。利用减压硅胶柱色谱、SephadexLH-20凝胶柱色谱及高效液相色谱技术,并结合生物自显影模型PQSI2对群体感应抑制剂进行追踪分离,得到纯度在98%以上的群体感应抑制活性化合物。经阳离子质谱及核磁谱鉴定抑制活性化合物为法卡林二醇。在亚抑菌浓度范围内,法卡林二醇对铜绿假单胞菌毒力因子弹性蛋白酶、绿脓菌素和鼠李糖脂等产量具有较好的抑制活性；在10μM浓度下其对绿脓菌素产量抑制程度可以达到70%。法卡林二醇不仅对铜绿假单胞菌swarming运动具有较好的抑制效果,而且在20μM浓度下其对铜绿假单胞菌生物被膜的降低程度达60%。实时荧光定量PCR检测结果表明法卡林二醇可以有效抑制铜绿假单胞菌las、rhl和pqs群体感应调控系统相关基因的表达水平。本实验研究首次成功构建了用于铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统抑制物的高通量筛选模型PQSI1及用于群体感应抑制剂追踪的生物自显影模型PQSI2。利用两种模型的有效结合分离得到羌活中群体感应抑制剂法卡林二醇。法卡林二醇是伞形科植物中广泛存在的一种化合物,其具有抗菌、抗炎、镇痛及解体热等活性。本文首次证明法卡林二醇在亚抑菌浓度下可以有效抑制铜绿假单胞菌群感应调控系统,降低与细菌感染相关的弹性蛋白酶、鼠李糖脂及绿脓菌素等毒力因子的产量,为开发新型抗菌药物提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 0 前言
• 0.1 细菌感染及抗生素治疗困境
• 0.2 细菌群体感应调控系统及研究进展
• 0.2.1 细菌群体感应现象的提出
• 0.2.2 细菌群体感应调控系统的分类
• 0.2.3 群体感应信号分子特征
• 0.3 铜绿假单胞菌群体感应调控系统
• 0.3.1 铜绿假单胞菌群体感应调控系统组成
• 0.3.2 铜绿假单胞菌群体感应调控网路
• 0.3.3 铜绿假单胞群体感应调控与细菌感染关系
• 0.4 铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统
• 0.4.1 铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统信号分子合成及调节
• 0.4.2 铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统研究意义
• 0.5 群体感应调控系统抑制剂研究进展
• 0.5.1 群体感应抑制剂作用途径
• 0.5.2 群体感应系统抑制剂筛选模型
• 0.5.3 铜绿假单胞菌群体感应抑制剂研究进展
• 0.6 本文研究目的及意义
• 1. 喹诺酮信号系统抑制剂筛选模型的构建及灵敏性测试
• 1.1 实验材料、试剂及仪器
• 1.1.1 酶和试剂盒
• 1.1.2 试剂及溶液成分
• 1.1.3 菌株和质粒
• 1.1.4 设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 构建筛选模型质粒pPQSI1
• 1.2.2 模型质粒pPQSI2的构建
• 1.2.3 构建模型菌株PQSI1及PQSI2
• 1.2.4 PQSI1筛选模型条件确定及灵敏性检测
• 1.2.5 PQSI2筛选模型条件确定及灵敏性检测
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 筛选模型质粒pPQSI1及pPQSI2的构建
• 1.3.2 模型菌株PQSI1及PQSI2的构建
• 1.3.3 PQSI1筛选模型条件确定及灵敏性检测结果
• 1.3.4 PQSI2筛选模型条件确定及灵敏性检测
• 1.4 讨论
• 小结
• 2. 中药粗提物群体感应抑制活性检测及抑制剂分离纯化
• 2.1 实验材料、试剂及仪器
• 2.1.1 实验材料及试剂
• 2.1.2 实验设备
• 2.1.3 检测使用筛选模型菌株构建方法见1.2.3
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 中药粗提物的制备
• 2.2.2 中药粗提物的群体感应抑制活性检测
• 2.2.3 中药羌活对群体感应抑制活性分析
• 2.2.4 中药羌活粗提物中群体感应抑制活性化合物的分离纯化
• 2.2.5 群体感应抑制活性化合物F3-20-4结构鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 中药粗提物制备
• 2.3.2 中药粗提物群体感应抑制活性筛选结果
• 2.3.3 中药羌活甲醇粗提物群体感应抑制活性的确定
• 2.3.4 中药羌活中群体感应抑制活性化合物的分析
• 2.3.5 羌活中群体感应抑制活性化合物的分离纯化
• 2.3.6 活性化合物F3-20-4结构鉴定
• 2.4 讨论
• 小结
• 3. 法卡林二醇群体感应抑制活性评价
• 3.1 实验材料、试剂及仪器
• 3.1.1 酶和试剂盒
• 3.1.2 试剂及溶液成分
• 3.1.3 菌株和质粒
• 3.1.4 设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 法卡林二醇对铜绿假单胞菌PAOI亚抑菌浓度的测定
• 3.2.2 铜绿假单胞菌PAOI对法卡林二醇的生长曲线测定
• 3.2.3 法卡林二醇对铜绿假单胞菌las群体感应系统抑制活性的检测
• 3.2.4 检测法卡林二醇对铜绿假单胞菌喹诺酮群体感应系统抑制活性
• 3.2.5 铜绿假单胞菌毒力因子检测方法
• 3.2.6 铜绿假单胞菌生物被膜测定
• 3.2.7 法卡林二醇对铜绿假单胞菌Swarming运动影响检测
• 3.2.8 法卡林二醇对PAOI群体感应las及pqs系统的异源抑制作用检测
• 3.2.9 RT-PCR检测法卡林二醇对群体感应调控相关基因表达的影响
• 3.2.10 检测法卡林二醇对紫色杆菌群体感应抑制活性
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 法卡林二醇对铜绿假单胞菌PAOI亚抑菌浓度测定结果
• 3.3.2 法卡林二醇对铜绿假单胞菌PAOI生长曲线的绘制
• 3.3.3 法卡林二醇对铜绿假单胞菌las系统抑制活性
• 3.3.4 法卡林二醇对铜绿假单胞菌喹诺酮信号系统抑制活性检测结果
• 3.3.5 法卡林二醇对铜绿假单胞菌PAOI毒力因子产量的影响
• 3.3.6 法卡林二醇对PAOI生物被膜形成的影响
• 3.3.7 法卡林二醇对swarming运动的影响
• 3.3.8 异源检测法卡林二醇对铜绿假单胞菌1as及pqs系统的抑制作用结果
• 3.3.9 法卡林二醇对PAOI群体感应相关基因表达的影响
• 3.3.10 法卡林二醇对紫色杆菌群体感应抑制作用结果
• 3.4 讨论
• 小结
• 4 总结与展望
• 4.1 本课题研究主要取得以下几个方面的研究成果
• 4.2 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果