拟南芥抗灰葡萄孢毒素突变体筛选及其突变基因分析

论文摘要

灰葡萄孢是一种重要的植物病原真菌,常在蔬菜、水果、花卉上引致灰霉病,造成很大损失。毒素是灰葡萄孢重要的致病因子之一,但毒素与植物的互作机理尚不清楚。明确毒素作用方式,了解毒素作用机理,能为病菌致病机理的解析和抗病植株的培育提供依据。利用胚根生长抑制法和细胞膜透性改变法测定灰葡萄孢毒素对拟南芥的毒性作用。试验菌株用改良FriesⅢ号培养液培养,用氯仿提取得到粗毒素。用毒素处理拟南芥种子,可抑制种子发芽和胚根生长,且毒素浓度越高,抑制作用越强。毒素浓度为0.1%时,对种子发芽率没有影响,但显著抑制胚根生长,对胚根生长的抑制率为83%；当毒素浓度提高到0.2%时,种子发芽率减低,为97.2%,但胚根几乎不能生长；当毒素浓度为0.3%时,被处理的拟南芥种子全部丧失发芽能力。细胞膜透性测定结果表明,毒素能使拟南芥叶片细胞的膜透性改变,胞内电解质渗漏。当毒素浓度为0.1%时,对叶片细胞膜有轻微的损伤作用,损伤率为8.31%；毒素浓度为0.8%时,损伤作用较为明显,损伤率为53.72%；当毒素浓度提高到1%时,对细胞损伤率达65.48%。根据实验结果,建立了拟南芥对毒素敏感性的评价方法：采用胚根生长抑制法,毒素浓度为0.1%,拟南芥用MS培养基平板直立法培养,14d后测量胚根长度,计算胚根生长抑制率。拟南芥突变体库由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供,共12100个株系。用毒素为选择压力筛选突变体库,结果表明,大多数突变体对毒素非常敏感,在含毒素的培养基上不能发芽。但是第96组AM-96突变体对灰葡萄孢毒素敏感性下降,其发芽率为100%,胚根长度为0.6cm,而无毒素培养基中野生型拟南芥胚根长度1.42cm,毒素对AM-96胚根生长的抑制率为58%。利用毒素处理AM-96叶片,其症状明显轻于野生型叶片；接种病菌后,AM-96叶片仅出现轻微黄化,而野生型黄化严重且面积较大；从AM-96内能检测到插入序列片段,而野生型中未能测出；AM-96回复突变的植株AMR-96,对毒素的敏感性增加,与野生型植株相似,从其基因组中也未能检测到插入序列。因此,外源序列插入位点基因与拟南芥对毒素的敏感性有关。用Tail-PCR法分析AM-96基因组插入片段侧翼序列,并通过NCBI对其进行比对分析,发现该位点为拟南芥相关驱动蛋白序列（kinesin motor protein-related, KMPR）。对该蛋白进行生物信息学分析,发现在十多种植物中发现存在该蛋白,重要的栽培植物有葡萄、水稻、大麦、玉米、高粱等。采用最大简约法构建系统进化树,发现拟南芥的驱动蛋白与双子叶植物的亲缘关系较近。其变异的程度与进化的时间呈正相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 一、灰霉病发生与防治
• （一） 寄主植物种类
• （二） 病害流行特点
• （三） 防病措施与效果
• 二、灰葡萄孢的致病机制
• （一） 毒素
• （二） 胞壁降解酶
• （三） 其他
• 三、提高植物抗病性的途径
• （一） 植物抗病基因
• （二） 诱导抗性
• （三） 其它抗病因子
• 四、植物对灰葡萄孢的抗性机理
• （一） PGIP
• （二） 几丁质酶
• （三） 植保素以及其它物质
• 五、拟南芥抗病研究
• （一） 拟南芥特性
• （二） 拟南芥抗灰葡萄孢机理
• （三） 拟南芥突变体库的构建和应用
• 六、本研究的目的和意义
• 材料与方法
• 一、供试病原菌
• 二、供试植物
• 三、培养基及培养液
• （一） 真菌培养基
• （二） 毒素培养液
• （三） 拟南芥培养基
• （四） 拟南芥营养液配方
• 四、试剂和仪器
• （一） 主要试剂
• （二） 主要仪器
• 五、灰葡萄孢毒素的培养及提取
• 六、拟南芥的种植
• 七、拟南芥对毒素敏感性的检测方法
• （一） 胚根抑制法
• （二） 细胞膜透性检测法
• 八、毒素处理植株与病菌接种方法
• 九、拟南芥基因组DNA提取
• （一） DNA提取
• （二） DNA纯度和浓度测定
• 十、突变体T-DNA插入区序列测定方法
• （一） PCR引物设计
• （二） PCR反应体系
• （三） PCR反应条件
• （四） PCR产物纯化
• （五） 测序
• （六） 生物信息学分析
• 结果与分析
• 一、拟南芥对毒素的敏感性
• （一） 毒素对拟南芥胚根的抑制
• （二） 毒素对拟南芥细胞膜透性的影响
• 二、拟南芥对毒素敏感性的评价方法与标准
• 三、拟南芥抗毒素突变体的筛选
• （一） 筛选突变体
• （二） AM-96突变体验证
• 四、突变体基因分析
• （一） 突变体T-DNA标记基因序列检测
• （二） 突变位点基因序列分析
• 五、KMPR基因分析
• 六、KMPR生物信息学分析
• （一） 蛋白质一级结构
• （二） 蛋白质二级结构
• （三） 蛋白质性质与功能
• （四） KMPR蛋白系统进化
• 讨论
• 一、针对病菌毒素提高植物抗病性
• 二、毒素与植物抗病性鉴定
• 三、驱动蛋白
• 参考文献
• 附录
• 致谢