鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备及其免疫原性研究

论文摘要

禽致病性大肠杆菌可引起禽类的多种疾病,是目前危害养鸭业最为严重的传染病之一因其复杂的血清型和广谱的耐药性,给该病的防控提出了新的挑战。目前使用的灭活疫苗不能有效控制该疫病流行,因此有必要研制新型、高效的疫苗。细菌菌蜕（Bacterial ghosts, BC）是通过调控噬菌体的裂解基因E在革兰氏阴性菌中的表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳,保持了细菌原有的细胞形态、细菌表面抗原性和黏附性等特性,是一种比常规疫苗更理想的新型疫苗体系。与常规疫苗相比,菌蜕具有与活菌相同功能的膜抗原结构,可诱导机体同时产生体液免疫和细胞免疫,同时具有安全和易于运输保存等优点,使得菌蜕日益成为当前疫苗研究的热点。通过对鸭致病性大肠杆菌菌蜕疫苗的研制,为该病的防控提供新思路。本研究在PhiX174噬菌体的裂解基因E的基础上,利用pBV220载体的调控元件、启动子和终止子,共同表达了金黄色葡萄球菌核酸酶A基因（SN）, SN基因作为辅助基因能将细菌的核酸降解成100bp以下的小片段,更容易排出胞外提高裂解率。实验成功构建了高效率的温控重组溶菌质粒,其中的E基因和SN基因由各自的启动子启动表达,同受控于CIts857温敏调控元件,导入宿主菌鸭致病性大肠杆菌野生株DE17诱导后的裂解率可高达99.99%。制备的菌蜕在电镜下观察,其膜表面结构与活菌相同,而胞质内容物排出,呈典型的菌蜕结构。在制备细菌菌蜕的方法上,除了通过E基因,最近的研究表明可以利用细胞穿透肽（cell-penetrating peptide, CPP）快速制备大肠杆菌的菌蜕。本研究利用合成的细胞穿透肽MAP,通过MAP与DE17共作用发现,在一定浓度下可达到100%的灭活率。电镜检测结果表明,制备的细菌菌蜕有一定的胞质内容物泄露。在鸭免疫保护实验方面,无论加佐剂与否,细菌菌蜕均可以刺激机体产生比甲醛灭活苗更高的体液抗体水平。在LD5050倍攻毒菌量的情况下,加佐剂的菌蜕组与不加佐剂的菌蜕组保护率分别为90%和80%,而加佐剂的甲醛灭活苗组和不加佐剂的甲醛灭活苗组保护率分别为70%和40%,表明菌蜕比传统疫苗具有更高的实际保护效果。不加佐剂的细胞穿透肽MAP灭活苗组也达到70%的保护率,与加佐剂的甲醛灭活苗组保护率相当,其具体机制有待进一步研究。本研究构建了温控重组溶菌质粒,并合成了细胞穿透肽MAP,通过二者对鸭致病性大肠杆菌DE17的作用,成功高效的制备了其菌蜕,在动物免疫保护实验也显示出了比传统甲醛灭活苗更高的保护效率,是一种良好的候选疫苗,为菌蜕制备和防控禽致病性大肠杆菌的进一步研究提供了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述
• 1 禽致病性大肠杆菌的研究进展
• 2 细菌菌蜕的研究进展
• 3 细胞穿透肽研究进展
• 第二部分 实验内容
• 第一章 温控型溶菌载体的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二章 利用重组溶菌载体制备鸭致病性大肠杆菌菌蜕
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三章 利用细胞穿透肽制备鸭致病性大肠杆菌菌蜕
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四章 鸭致病性大肠杆菌菌蜕免疫效果评价
• 1. 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢