盲鳗、七鳃鳗、有颌类的进化关系和重组蛋白活性鉴定

论文摘要

第一篇基于生物信息学的48个基因家族的系统发生分析揭示盲鳗、七鳃鳗和有颌类的进化联系现存脊椎动物被公认为3个主要类群:盲鳗、七鳃鳗和有颌类。关于它们之间的系统进化关系,长期以来存在两种观点。一种传统的观点支持圆口纲理论认为盲鳗和七鳃鳗作为无颌类群体是较有颌类低等的脊椎动物;另一种观点认为七鳃鳗是有颌类的姐妹群体,盲鳗是较原始的脊椎动物。为了更清晰地阐明盲鳗、七鳃鳗和有颌类之间的系统发生关系,本文选择了三个类群中同源的48个基因家族进行系统进化分析。结果表明:其中34个核基因序列构建的进化树支持圆口纲理论,而14个线粒体基因序列构建的进化树揭示七鳃鳗是有颌类的姐妹群。本文经过各方面论证最终给出了支持圆口纲理论的依据。此外,外群的选择、构建系统发生树时所选择的软件和做树方法都将影响到系统发生关系的判断。因此,发展新的方法来解决这一问题是非常迫切的。第二篇重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L251蛋白表达纯化及活性鉴定本项课题根据日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中cDNA序列和部分EST预测功能基因片段,发现日本七鳃鳗口腔腺分泌物中大量存在选择性阻断T淋巴细胞Kv1.3通道样蛋白质,命名为L251。L251属于CRISP蛋白家族,该家族在结构上具有三个区域:N端的PR-1结构域（Pathoegenesis-related group 1 domain）、C端的CRD结构域（Cysteine-rich domain）以及连接这两个结构域的一段稳定的铰链区。通过大量相关蛋白结构与功能的分析和比对,得出L251蛋白与CRISP家族特有的代表性结构域—CRD具有相同的保守序列和功能位点。根据序列特异性和酶切位点设计特异性引物,将L251功能基因从cDNA文库中调取全长基因,连接到pET23b,转化到大肠肝菌Rosetta表达菌中诱导表达出包涵体蛋白质,经变性,亲和层析纯化和复性得到L251蛋白。用Dynal T Cell Negative Isolation Kit Ver II分选健康人外周血T淋巴细胞进行L251蛋白活性检测。结果表明:细胞计数和MTT检测,L251在0.1ug/mL,0.3 ug/mL , 0.5 ug/mL ,0.7ug/mL浓度梯度内对T淋巴细胞增殖有抑制作用并呈现剂量依赖;细胞周期检测显示,在以上浓度梯度内L251将分裂期细胞阻断在G1/S并呈现剂量依赖;流式细胞仪FL-1通道检测CFSE染色,荧光强度的变化表明L251对T淋巴细胞增殖的抑制作用。自身免疫性疾病病人的T淋巴细胞Kv1.3通道高表达,正常细胞仅有少量表达。Kv1.3通道阻滞剂的高度特异性和专一性使免疫抑制治疗自身免疫性疾病而不损害全部细胞免疫这个新途径成为现实。L251蛋白有望成为Kv1.3通道阻滞剂,作为一种新的免疫抑制剂其更高的特异性和更少的损害将成为比经典免疫抑制更具吸引力的目标。该实验结果为我们进一步搭建L251和Kv1.3通道的作用模型提供了一定依据。

论文目录

• 第一篇
• 摘要
• Abstract
• 第二篇
• 摘要
• Abstract
• 第一篇 基于生物信息学的48 个基因家族的系统发生分析揭示盲鳗、七鳃鳗和有颌类进化联系
• 第一章 基因与基因组进化研究中的生物信息学
• 1.1 生物信息学概述
• 1.2 基因家族进化研究中的若干概念简述
• 1.2.1 基因家族与蛋白质家族
• 1.2.1.1 基因家族
• 1.2.1.2 蛋白质家族
• 1.2.2 系统发生分析与系统发生树
• 1.2.3 基因或蛋白家族分析方法和步骤
• 1.2.4 基因家族进化研究中存在的问题
• 第二章 盲鳗，七鳃鳗，有颌类进化关系的研究进展
• 2.1 传统的圆口纲分类及我国的主要种类
• 2.2 最古老脊椎动物的活化石
• 2.3 进化关系的研究进展
• 第三章 48 个基因家族的系统发生分析及其探讨盲鳗、七鳃鳗和有颌类的进化联系
• 3.1 数据的获得
• 3.1.1 下载数据
• 3.1.2 可用序列的检测
• 3.2 分析方法
• 3.2.1 序列串联
• 3.2.2 构建系统发生树
• 3.2.3 选用不同的外群建树
• 3.3 结果
• 3.3.1 系统发生树阐明进化关系
• 3.3.2 串联序列构建的系统树
• 3.4 讨论
• 3.4.1 圆口纲理论的争议
• 3.4.2 外群选择对系统进化树的影响
• 3.4.3 软件算法对系统进化树的影响
• 第四章 全文总结
• 第二篇 重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L251 蛋白表达纯化及活性鉴定
• 第一章 文献综述
• 1.1 CRD 蛋白及其CRISP 家族
• 1.1.1 CRISP 家族概述
• 1.1.2 CRD 蛋白及其生化特性
• 1.2 T 淋巴细胞与自身免疫性疾病
• 1.2.1 T 淋巴细胞
• 1.2.2 自身免疫性疾病
• 第二章 L251 蛋白的表达及纯化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 功能基因的EST 搜索
• 2.1.2.2 总RNA 的提取
• 2.1.2.3 调取目的基因并构建至质粒表达载体
• 2.1.2.4 将获取目的cDNA 的pET23b 载体转化入表达菌Rosetta 后进行阳性转化子的筛选鉴定；
• 2.1.2.5 对阳性重组子进行终浓度为1mmol/L 的IPTG 诱导表达
• 2.1.2.6 采用 SDS-PAGE 法对可溶性蛋白进行分析
• 2.1.2.7 对表达的重组蛋白进行变性条件下的组氨酸亲和层析纯化
• 2.1.2.8 L251 蛋白的复性
• 2.1.2.9 蛋白含量测定
• 2.2 结果
• 2.2.1 L251 的重组表达及纯化
• 2.3 讨论
• 第三章 T 淋巴细胞的分选
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 MNC 准备
• 3.1.2.2 预洗磁珠
• 3.1.2.3 从MNC 中分选T 细胞
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 第四章 MTT 法检测T 淋巴细胞增殖抑制
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 细胞周期法检测T 淋巴细胞增殖抑制
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.3 讨论
• 第六章 CFSE 法检测T 淋巴细胞增殖抑制
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.3 讨论
• 第七章 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 附录Ⅰ. 48 个蛋白及选择物种
• 附录Ⅱ
• 附录Ⅲ. pET23b 质粒图谱
• 附录Ⅳ：SDS-PAGE 所需试剂
• 附录Ⅴ：亲和层析纯化所需试剂
• 发表论文
• 致谢