论文摘要
鸡CD4和CD8分子是T细胞表面I型跨膜糖蛋白,作为TCR的辅受体参与对MHC分子递呈抗原的识别。ChCD4+ T细胞识别MHC II类分子递呈的抗原,而ChCD8+ T细胞识别MHC I类分子递呈的抗原并能激起细胞毒功能。ChCD4+和CD8+ T细胞与MHC分子的相互作用能加强MHC分子和TCR之间结合的亲和力。除了作为细胞黏附分子发挥作用外,它们还是传递信号的分子。ChCD4和ChCD8辅受体在胞浆中都与酪氨酸激酶p56lck结合,这对TCR/CD3复合物激活T细胞极为重要。ChCD4和ChCD8分子在胸腺细胞发育和成熟T细胞介导的免疫防御中起重要作用。因此,深入研究ChCD4和ChCD8将有利于我们了解这些辅受体在家禽免疫防御中的作用,从而为阐明疾病的免疫机理奠定基础。本研究利用Flp/FRT重组系统,将Flp重组酶表达载体pOG44与带有白莱航鸡CD4或CD8α基因序列的真核表达载体pcDNA5/FRT共转染Flp-In-293细胞,在Flp重组酶介导下使Flp-In-293细胞中的FRT位点与真核表达载体pcDNA5/FRT中的FRT位点发生特异性重组,经Hygromycin B抗性压力筛选获得了表达ChCD4、ChCD4-FLAG、ChCD8α或ChCD8α-FLAG的稳定细胞系,这为研制针对ChCD4、ChCD8α的单克隆抗体（mAb）奠定了基础。1.鸡CD4、CD8α真核表达质粒的构建与表达分别用BamH I、Apa I和BamH I、Xho I从pcDNA3.1-CD4和pcDNA3.1-CD8中切出白莱航鸡CD4和CD8α基因,并插入pcDNA5/FRT载体中,构建出真核表达质粒pcDNA5/FRT-CD4和pcDNA5/FRT-CD8α。用PCR方法扩增去除C端终止子的ChCD4和ChCD8α基因片段,经Kpn I和Xba I双酶切后插入pcDNA3.1-FLAG载体,使其C端带有FLAG标签;然后用Kpn I和Apa I将目的片段ChCD4-FLAG和ChCD8α-FLAG切下插入pcDNA5/FRT载体,最后构建出真核表达质粒pcDNA5/FRT-CD4-FLAG和pcDNA5/FRT-CD8α-FLAG。分别将ChCD4、ChCD8α及C端带有FLAG标签的四种真核表达质粒瞬时转染Flp-In-293细胞,孵育48h后,FACS检测结果表明,四种真核表达质粒pcDNA5/FRT-CD4、pcDNA5/FRT-CD8α、pcDNA5/FRT-CD4-FLAG、pcDNA5/FRT-CD8α-FLAG构建正确且都能在Flp-In-293细胞膜上表达,且C端带有FLAG标签不影响目的蛋白的表达。2.稳定表达鸡CD4、CD8α的Flp-In-293细胞系建立采用脂质体转染法,将重组酶表达载体pOG44与四种pcDNA5/FRT真核表达质粒分别共转染Flp-In-293细胞,孵育48h后,用含120μg/ml Hygromycin B的完全培养基1:10稀释进行抗性筛选,每4-5天换液一次,3-4周后挑取克隆扩大培养并作FACS鉴定,获得表达ChCD4的细胞克隆,分别命名为C1、C2、C7;表达ChCD4-FLAG的细胞克隆,分别命名为D1、D6、D8;表达ChCD8α的细胞克隆,命名为E1;表达ChCD8α-FLAG的细胞克隆,分别命名为F1、F2、F3、F4。FACS、直接免疫荧光、间接免疫荧光分析表明, ChCD4和ChCD8α均在Flp-In-293细胞膜上表达,C端FLAG标签也得到了表达;β-半乳糖苷酶活性及Zeocin抗性分析表明,lacZ-Zeo融合蛋白在筛选过程中依然部分存在;选取C1、D1和E1、F1在抗性压力下长期培养后,FACS检测表明,目的蛋白能稳定表达;正常条件培养及饥饿20h培养F1、F2、F3、F4后裂解细胞进行SDS-PAGE电泳,转印后以FLAG单抗为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗进行Western blotting,ECL显色,四个克隆均在35kDa处有目的条带,阴性对照E1及未转染细胞均无任何条带。饥饿培养与正常条件培养的细胞条带差异不大,说明有无血清刺激均不影响细胞表达ChCD4或ChCD8α分子。以鼠抗鸡CD8α纯化抗体为一抗进行Western blotting,F1、F2、F3、F4均在预期的35kDa处有目的条带。
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