新城疫病毒反向遗传操作基础与应用研究

论文摘要

单股负联不分节段负链RNA病毒（Non-segments negative strand RNA virus，NSNSV）主要包括副粘病毒、弹状病毒、波纳病毒和丝状病毒，是引起动物和人类传染性疾病的一群重要疫病原。NSNSV的反向遗传操作（Reverse genetic）是通过病毒基因组cDNA操作获得病毒的过程，是90年代后期出现的新型病毒学技术，是病毒学基础和应用研究极为重要的技术手段和工具平台。通过反向遗传操作系统（reverse genetic system）对病毒基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰，可获得相应的突变、重组病毒或疫苗株。 一、新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统建立 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）为不分节段单股负链RNA病毒，作为副粘病毒科的重要成员和模型病毒，得到深入研究。重组NDV作为活病毒载体疫苗具有非凡的优点：1、NDV弱毒疫苗可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，其安全有效性已被充分证明；2、NDV遗传相对稳定，仅有一个血清型；3、可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼或注射多种方式给苗，使用极为方便；4、NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本极为低廉。我国新城疫疫情复杂，发病死亡率高，对养禽业造成的损失巨大，新生雏鸡都要进行新城疫免疫。NDV作为活病毒疫苗载体应用意义巨大。 本研究以我国自行选育的一株NDV弱毒LaSota疫苗株为载体，建立了相应的反向基因操作系统，通过病毒基因组cDNA的操作，成功获得感染性拯救病毒rLaSota，并构建了表达增强的绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组病毒rLaSota-EGFP。研究表明，rLaSota-EGFP保持了野生型LaSota疫苗株高滴度的的鸡胚生长特性、对易感雏鸡的低致病性及良好的免疫原性，并且鸡胚连续传代20代次以上保持低致病性和外源基因EGFP的稳定表达不变。 在此基础上，构建了一系列表达传染性法氏囊病毒超强毒（very virulence infectious bursal disease virus，vvIBDV）分离株VP2抗原基因和H5亚型高致病力禽流感病毒（Avian influenza virus）分离株HA抗原基因的重组NDV，并对其生物学特

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 综述部分
• 文献综述
• 1.负链RNA病毒生命周期的简单回顾
• 2.负链RNA病毒反向遗传操作系统研究进展
• 3.不分节段负链RNA病毒的复制和转录
• 3.1 基因结束信号
• 3.2 基因间隔区
• 3.3 基因起始信号
• 3.4 复制
• 3.5 “六碱基规则”
• 4.负链RNA病毒的蛋白质组成
• 4.1 磷蛋白（P）
• 4.2 基质蛋白（M）
• 4.3 糖蛋白
• 4.4 附属蛋白
• 5.负链RNA病毒反向遗传操作系统及其应用研究
• 5.1 活病毒载体
• 5.2 基因传递粒子
• 5.3 致弱活病毒疫苗
• 6.新城疫病毒反向遗传操作系统及其应用研究
• 6.1 新城疫病毒概况
• 6.2 新城疫病毒致病力的分子基础
• 6.3 新城疫病毒的反向遗传操作
• 6.4 新城疫病毒作为活病毒载体的应用前景
• 7.展望未来
• 参考文献
• 实验部分
• 第一章：新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞和病毒
• 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 病毒基因组的提取、反转录和PCR
• 1.6 RT-PCR产物的克隆
• 1.7 辅助质粒的构建
• 1.8 基因组全长cDNA克隆的构建
• 1.9 病毒拯救
• 1.10 间接免疫荧光（IFA）
• 1.11 拯救病毒的致病性试验
• 1.12 拯救病毒的鸡胚生长特性
• 1.13 免疫及攻毒保护试验
• 2.结果
• 2.1 辅助质粒的构建
• 2.2 NDV LaSota株基因组全长cDNA的构建
• 2.3 从全长cDNA克隆拯救重组病毒
• 2.4 间接免疫荧光试验（IFA）
• 2.5 rLaSota在鸡胚内的生长特性
• 2.6 rLaSota的致病性
• 2.7 rLaSota的免疫原性及其对强毒攻击免疫保护效果
• 2.8 核酸序列号
• 3.讨论
• 参考文献
• 第二章：表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞和病毒
• 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 引物
• 1.5 表达EGFP重组基因组全长cDNA的构建
• 1.6 重组病毒的拯救及鉴定
• 1.7 重组病毒EGFP稳定表达检测
• 1.8 重组病毒的致病性试验
• 1.9 重组病毒的鸡胚生长特性
• 1.10 免疫及攻毒试验
• 2.结果
• 2.1 重组病毒基因组全长cDNA的构建
• 2.2 从全长cDNA克隆拯救重组病毒
• 2.3 rLaSota-EGFP外源报告基因的稳定表达
• 2.4 rLaSota-EGFP在鸡胚的生长特性
• 2.5 rLaSota-EGFP的致病性
• 2.6 rLaSota-EGFP的免疫原性及免疫攻毒保护试验
• 3.讨论
• 参考文献
• 第三章：传染性法氏囊病毒超强毒株VP2基因重组新城疫病毒活载体疫苗的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞、病毒和材料
• 1.2 SPF鸡和SPF鸡胚
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 引物
• 1.5 表达VP2基因的病毒基因组cDNA克隆的构建
• 1.6 重组病毒的拯救
• 1.7 间接免疫荧光（IFA）
• 1.8 Western-blot检测VP2蛋白表达
• 1.9 重组病毒致病性分析
• 1.10 重组病毒生长动力学比较
• 1.11 免疫及攻毒保护试验
• 2.结果
• 2.1 重组型NDV基因组全长cDNA的构建
• 2.2 从全长cDNA克隆拯救重组型NDV
• 2.3 间接免疫荧光试验（IFA）检测VP2蛋白表达
• 2.4 Western-blot检测VP2抗原表达
• 2.5 重组病毒在鸡胚生长特性分析
• 2.6 重组病毒遗传稳定性及致病性分析
• 2.7 重组病毒诱导保护性抗体的效果
• 2.8 免疫鸡法氏囊的病理组织学变化
• 3.讨论
• 参考文献
• 第四章：H5N1亚型禽流感病毒HA基因重组新城疫病毒活载体疫苗的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 细胞和病毒
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 试验动物
• 1.4 引物
• 1.5 病毒RNA的提取、反转录和PCR
• 1.6 表达HA基因的基因组全长cDNA的构建
• 1.7 重组病毒的拯救
• 1.8 RT-PCR鉴定及序列测定
• 1.9 间接免疫荧光检测（IFA）
• 1.10 Western-blot检测重组病毒HA基因表达
• 1.11 重组病毒HA基因稳定表达检测
• 1.12 重组病毒的致病性试验
• 1.13 重组病毒的鸡胚生长特性
• 1.14 重组病毒对雏鸡的免疫试验
• 2.结果
• 2.1 表达HA基因的NDV全基因组cDNA克隆的构建和重组病毒的拯救
• 2.2 间接免疫荧光试验（IFA）
• 2.3 Western-blot检测重组病毒HA基因表达
• 2.4 重组病毒的遗传稳定性
• 2.5 重组病毒的致病性试验
• 2.6 重组病毒鸡胚生长动力学
• 2.7 重组病毒对SPF雏鸡的安全性
• 2.8 重组病毒不同剂量免疫后的HI抗体反应
• 2.9 重组病毒对SPF雏鸡的免疫攻毒保护试验
• 2.10 重组病毒对SPF雏鸡的免疫持续期研究
• 3.讨论
• 参考文献
• 第五章 表达H5亚型高致病力禽流感HA基因的重组新城疫病毒对小鼠安全性和免疫原性研究
• 1.材料与方法
• 1.1 病毒
• 1.2 实验动物
• 1.3 重组病毒对小鼠的安全性试验
• 1.4 重组病毒对小鼠的攻毒保护试验
• 2.结果
• 2.1 重组病毒对小鼠的安全性评估
• 2.2 重组病毒免疫小鼠对H5亚型高致病力禽流感病毒的交叉保护实验
• 3.讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 附录
• 致谢
• 简历