微生物发酵法产透明质酸工艺研究

论文摘要

透明质酸也称为玻璃酸（Hyaluronic acid简称HA）是一种生物相容性很好的生物聚合物,广泛存在于动物和人体结缔组织细胞外基质及部分细菌中的一种高分子粘多糖。由D-葡萄糖醛酸（glucuronic acid）和N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）通过β-1,4和β-1,3糖苷键反复交替连接而成。由于其优良的保湿和润滑性状现已经被广泛运用于化妆品和医疗领域中。透明质酸的制备可以分为传统的动物提取法和比较现代的微生物发酵法两种形式。近几年,随着微生物发酵法生产HA技术的不断改进和完善,发酵法大有完全取代提取法的趋势。本文对于微生物发酵生产透明质酸的工艺过程进行了系统的阐述,主要从以下几个方面进行了的分析和研究,并得到了相关的结论。经过人工筛选,得到一株改良性状的透明质酸产生菌株,通过对菌株的研究和培养,建立了一套适合于微生物发酵生产HA菌株的复壮（活化）、保藏的方式,简化了制备种子的工艺,使菌株的优良性状得以保存,缩短了发酵的周期。为工业发酵产生HA奠定了基础。通过500mL摇瓶水平的单因素试验和多因素响应面试验初步确定菌株发酵培养基的成分。即葡萄糖浓度27.49 g/L,酸水解酪蛋白浓度为2 g/L,酵母粉浓度1.0745 g/L,硫酸铵浓度为2 g/L,硫酸镁浓度为0.5 g/L,磷酸氢二钾浓度为1.9 g/L。确定了菌株摇瓶发酵的适宜培养条件。绘制出种子培养基中菌体的生长曲线,取812 h为接种的适宜种龄,发酵培养基中的适宜装液量确定为30 mL/500 mL ,产物HA积累的最适温度为37℃,最适初始pH值为7.0。确定了小型发酵罐发酵时的适宜培养条件及生产条件。在发酵罐水平上探索了适于产物代谢的适宜温度为37℃,PH值为7.0;整个发酵过程采取较低的通氧速率3 L/min,搅拌速率采用转速600 r/min的调控方式。确定了透明质酸的分离提纯工艺。经过一系列提取纯化步骤:乙醇沉淀、沉淀物溶解、过滤、CPC络合、HA-CPC解离、成品沉淀、脱水、真空冷冻干燥等,得到成品。成品最终的各项指标接近于化妆品级的标准。整个提纯工艺的收率在92%左右,产品纯度97.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章引言
• 1.1 透明质酸的概述、分布、性质及生理功能
• 1.1.1 透明质酸的概述
• 1.1.2 透明质酸的分布
• 1.1.3 透明质酸的结构
• 1.1.4 透明质酸的性质及生理功能
• 1.2 透明质酸的应用领域
• 1.2.1 透明质酸在化妆品中的应用
• 1.2.2 透明质酸在关节病中应用
• 1.2.3 透明质酸在眼科疾病中的应用
• 1.2.4 透明质酸在促伤口愈合和防粘连中的应用
• 1.2.5 血清中透明质酸的检测
• 1.2.6 透明质酸在健康食品中的应用
• 1.2.7 透明质酸在耳科疾病中的应用
• 1.3 透明质酸的制备方法
• 1.3.1 动物组织中提取法
• 1.3.2 微生物发酵法制备透明质酸概况
• 1.4 透明质酸的前景及需解决的问题
• 1.5 研究目的
• 第二章透明质酸产生菌的人工筛选、复壮及保藏
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 仪器设备（参见附录A）
• 2.3 方法
• 2.3.1 筛选培养基确定及菌种的筛选
• 2.3.2 菌种的复壮（活化）
• 2.3.3 菌种的保藏
• 2.4 结果和讨论
• 2.4.1 筛选培养基的确定
• 2.4.2 菌种活化的结果
• 2.4.3 菌种保藏的结果
• 2.5 本章小结
• 第三章摇瓶发酵培养基的确定及单因素试验
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 菌体吸光度的测定
• 3.3.2 葡萄糖浓度测定
• 3.3.3 发酵液黏度的测定
• 3.3.4 发酵液中透明质酸的测定
• 3.4 结果和讨论
• 3.4.1 液体摇瓶发酵培养基单因子试验
• 3.4.2 菌体的生长曲线及接种时间的确定
• 3.5 本章小结
• 第四章 摇瓶发酵培养基响应面试验
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 菌体浓度测定
• 4.3.2 透明质酸含量的测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 摇瓶发酵响应面试验
• 4.5 本章小结
• 第五章 透明质酸发酵罐分批发酵的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料
• 5.2.1 试剂
• 5.3 方法
• 5.3.1 菌体干重测定
• 5.3.2 透明质酸含量的测定
• 5.3.3 发酵液黏度测定
• 5.4 结果和讨论
• 5.4.1 发酵罐搅拌转速对于菌体的影响
• 5.4.2 发酵罐中底物消耗及产物的生成
• 5.4.3 微发酵罐中生物生长曲线及生物量
• 5.4.4 发酵罐中发酵结果
• 5.5 本章小结
• 第六章 透明质酸的下游提取技术
• 6.1 引言
• 6.2 材料
• 6.2.1 试剂
• 6.2.2 仪器设备
• 6.3 方法
• 6.3.1 透明质酸含量的测定
• 6.3.2 分子量的测定
• 6.3.3 蛋白质的测定：考马斯亮蓝染色法
• 6.3.4 采用乙醇沉淀和CPC 络合的方法
• 6.4 结果和讨论
• 6.4.1 乙醇沉淀
• 6.4.2 沉淀溶解
• 6.4.3 过滤
• 6.4.4 氯代十六烷基吡啶（CPC）络合
• 6.4.5 HA-CPC 络合物解离
• 6.4.6 成品沉淀
• 6.4.7 脱水并干燥
• 6.5 本章小结
• 第七章 总结
• 参考文献
• 附录A 试验中用到的试剂、仪器设备
• 附录B 本试验中用到的培养基及培养方法
• 附录C 透明质酸含量测定方法
• 附录D 透明质酸中的蛋白质测定
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢