导读:本文包含了表型筛选论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:希金斯刺盘孢,农杆菌介导转化,突变体,致病性
表型筛选论文文献综述
周鹏,顾琼楠,黄俊斌,郑露[1]（2019）在《希金斯刺盘孢T-DNA插入突变体表型筛选及其特性分析》一文中研究指出以希金斯刺盘孢菌株Ch-1为供试野生型菌株,通过农杆菌介导转化方法获得含2 000个转化子的T-DNA插入突变体库,筛选菌落生长异常或致病缺陷突变体,分析致病缺陷突变体的T-DNA插入拷贝数和位点。结果显示,筛选到14株菌落异常突变体,包括2株生长缓慢突变体Ch-1-E393和Ch-1-C135、12株菌落形态异常突变体(包括色素异常、菌落扇变或菌丝坍塌现象),另外筛选到1株致病缺陷突变体Ch-1-G090。致病性测定结果表明,致病缺陷突变体Ch-1-G090接种拟南芥后,叶片发病明显减弱,且未产生水渍状病斑。显微观察发现该突变体分生孢子在叶片上仅能产生少量初生菌丝,不能正常形成次生菌丝。Southern杂交显示,致病缺陷突变体Ch-1-G090为T-DNA双拷贝插入;通过Inverse-PCR法获得插入T-DNA的侧翼序列,明确该突变体T-DNA插入位点分别为假定蛋白(Ch063_10682)和RNA加工蛋白FCF1(CH063_10671)编码区。(本文来源于《华中农业大学学报》期刊2019年04期）
张志康[2]（2019）在《基于巨噬细胞极化表型筛选吡唑联苯基酰胺治疗脑脊髓炎的分子机制研究》一文中研究指出研究目的:多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是临床常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病,其病理进程可引起脑和脊髓的损伤进而严重影响患者的生存质量。目前临床上采取的治疗手段如免疫调节剂芬戈莫德只能在一定程度上延缓疾病进展,无法从根本上修复受损髓鞘和预防炎症。M1型极化的巨噬细胞分泌炎性因子导致炎症的发生,而M2型极化的巨噬细胞则有利于髓鞘和轴突的修复,并有抑制炎症的作用,从而兼具髓鞘修复和免疫调控的作用。本课题通过实验室内部的化合物库筛选得到促进巨噬细胞M2型极化的新型化合物骨架结构,并对这种化合物骨架进行结构优化,研究其对多发性硬化症的治疗作用和分子机制。研究方法:1.调控巨噬细胞极化的化合物筛选:1)RAW264.7小鼠巨噬细胞株给予具有不同骨架的化合物,单独作用24h采用qRT-PCR检测巨噬细胞M2型基因Arg1和M1型基因Mcp1的mRNA变化水平;2)RAW264.7小鼠巨噬细胞株预先用LPS刺激24h后给予具有不同骨架的化合物作用24h,采用qRT-PCR检测巨噬细胞M1型基因Mcp1的mRNA变化水平;3)原代巨噬细胞(Bone Marrow Derived Macrophages,BMDMs)经筛选及优化得到的D11作用24h后,采用qRT-PCR检测巨噬细胞M2型基因Arg,Mrc1和Fizz1及M1型基因Inos,Mcp1和Cd86的mRNA变化水平,采用流式细胞术检测M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例;4)BMDMs预先用LPS刺激24h后,给予D11作用24h,采用qRT-PCR检测巨噬细胞M1型基因Inos,Mcp1和Cd86的mRNA变化水平,采用流式细胞术检测M1型巨噬细胞(CD86+F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例。2.D11对树突细胞成熟和CD4+T细胞增殖分化的影响:1)采用流式细胞术检测BMDCs经D11作用24h和对照组成熟的树突细胞(MHC-Ⅱ+CD11C+)和(CD80+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例;2)采用IL-6和IL-12 ELISA检测试剂盒检测BMDCs经D11作用24h后和对照组细胞培养液中的IL-6和IL-12水平;3)用naive CD4+ T细胞分离试剂盒从C57BL/6小鼠淋巴结中分离幼稚CD4+ T细胞,加入anti-CD3(11g/ml),anti-CD28(5 μg/ml),在1640培养基+10%FBS中培养72h,在最后24h加入D11,流式检测Th1诱导条件下(IL-121 μg/ml)Th1细胞(CD4+ IFN-γ+)占CD4+T细胞的比例及Th17诱导条件下(IL-6 2.5 ng/ml、TGF-β 1 ng/ml)Th17 细胞(CD4+ IL-17+)占 CD4+T细胞的比例;4)BMDMs经D11作用24h后与经CFSE标记的CD4+ T细胞共培养48h,流式检测增殖的CD4+T细胞占CD4+细胞的比例。3.D11药代动力学研究:选择检疫合格SD大鼠8只(雌雄各半),分成2组,即D11灌胃组和D11静脉注射组,每组4只SD大鼠,雌雄各半。灌胃组于灌胃前和灌胃后10min、30min、lh、2h、3h、4h、8h、24h和48h分别尾静脉取血,每只动物每次采血量不多于0.2 ml。静注组于给药前和给药后5 min、15 min、30 min、1h、2 h、4 h、8 h、24h和48h分别取血,每只动物每次采血量不多于0.2ml。取血浆样品,加入3倍量含内标0.20 μg/ml的甲醇液沉淀蛋白,涡漩10 min,10000 r/min离心10 min,取上清液进样分析。LC-MS分析采用正离子方式检测。将所得浓度-时间数据,用DAS 3.0药代动力学软件,采用统计矩法进行计算,得到大鼠灌胃和静注给予D11后主要吸收动力学参数AUC(0-t)、AUC(0-∞)Cmax、Tmax等。4.D11对MS小鼠模型EAE的治疗作用及机制研究:选择检疫合格C57BL/6小鼠,使用MOG35_55诱导经典的MS小鼠模型EAE,从造模第8天开始,每天1天,连续19天灌胃给于不同剂量的D11。1)采用Kono's法每天对各组EAE造模小鼠的临床症状打分,并每天记录各组小鼠的体重变化;2)采用苏木精-伊红(Hematoxy1in&Erosin,HE)和坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色评价D11对小鼠脊髓炎性和髓鞘损伤的保护作用;3)采用流式细胞术检测EAE小鼠体内Th1细胞(CD4+IFN-γ+)和Th17细胞(CD4+ IL-17+)占CD4+T细胞的比例;4)采用流式细胞术检测小鼠体内M1(CD86+F4/80+)型和M2型(CD206+F4/80+)巨噬细胞在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例;5)采用流式细胞术检测小鼠体内成熟的树突细胞(MHC-II+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例;6)采用流式细胞术检测小鼠体内Treg细胞(CD4+FOXP3+)占CD4+T细胞的比例。5.D11促进巨噬细胞M2型极化机制研究:1)采用基因芯片技术(microarray)分析D11给药和对照组的巨噬细胞基因组表达水平;2)采用Western Blot技术检测D11给药后STAT3,AKT和STAT6的激活情况;3)采用流式细胞术检测LysmcreSTAT3+fl小鼠和LysmcreSTAT3fl/fl小鼠来源BMDMs的M1和M2型分别在巨噬细胞中所占比例;4)采用流式细胞术检测Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠来源BMDCs成熟的树突细胞在树突细胞中所占比例;5)采用IL-6和IL-12 ELISA检测试剂盒检测Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STATH3fl/fl小鼠来源BMDCs细胞培养液中的IL-6和IL-12水平;6)对Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠进行EAE造模,每日进行临床症状打分,并每天记录两组小鼠的体重变化;7)采用流式细胞术检测小鼠体内M1型和M2型巨噬细胞在巨噬细胞中所占比例及成熟的树突细胞在树突细胞中所占比例;8)采用流式细胞术检测小鼠中枢免疫器官中外周浸润巨噬细胞(CD45hi CD11bhi)和小胶质细胞(CD45intCD11bhi)M1型和M2型所占比例。研究结果:1.调控巨噬细胞极化的化合物筛选28种具有代表性的结构骨架化合物(S-1～S-28)分别作用Raw264.7 24h后,S-2、S-9、S-11、S-28可显着促进巨噬细胞M2型基因Arg1mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:S-2:7.3 倍、S-9:8.1 倍、S-11:7.0 倍、S-28:10.1 倍),S-9、S-13、S-16、S-18可显着促进巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:S-9:3.3 倍、S-13:3.0 倍、S-16:2.7 倍、S-18:3.5 倍)。基于相似性从 Molport数据库搜索得到的S-28结构类似物(A1～A10)分别作用Raw264.7 24h后,A2可显着促进巨噬细胞M2型基因Arg1 mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:A2:4.9倍)但作用弱于S-28,巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA表达无明显变化(p>0.05,n=3)。S-28的手性化合物B1作用Raw264.7 24h后,巨噬细胞M2型基因Arg1,M1型基因Mcp1 mRNA表达无明显变化(p>0.05,n=3)。S-28的a-b环及c-d环结构类似物(C1～C11)分别作用Raw264.7 24h后,巨噬细胞M2型基因Arg1,M1型基因Mcp1mRNA表达无明显变化(p>0.05,n=3)。S-28的不同取代基化合物(DI～D21)分别作用Raw264.7 24h后,D8、D9、D10、D11、D12、D13、D15可显着促进巨噬细胞M2型基因Arg1mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:D8:10.1 倍、D9:8.4 倍、D10:6.5 倍、D11:14.0 倍、D12:10.1倍、D13:5.1倍、D15:10.3倍),D14、D15、D16可显着促进巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA 表达(p<0.05,n=3,上调倍数:D14:4.85 倍、D15:3.54 倍、D16:5.08倍)。2.D11对树突细胞成熟和CD4+ T细胞增殖分化的影响流式检测结果显示,化合物D11作用原代树突细胞BMDCs24h后,分化成熟的树突细胞(CD80+CD11C+)、(MHC-Ⅱ+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例没有发生明显变化(p>0.05,n=3)。ELISA结果显示,成熟树突细胞分泌的细胞因子IL-6和IL-12在D11给药后也没有发生明显变化(p>0.05,n=3)。化合物 D11 作用 CD4+T 细胞 24h,CD4+T 细胞分化成 Th1(CD4+IFN-γ+)和 Th17(CD4+IL-17+)均没有明显受到药物的影响(p>0.05,n=3)。BMDMs经D11作用24h后与经CFSE标记的CD4+T细胞共培养48h,增殖的CD4+T细胞占总CD4+细胞的比例显着降低(p<0.05,n=3)。且CD4+ T细胞和BMDMs共培养的上清液中炎性因子IFN-γ和IL-17的浓度显着降低(p<0.05,n=3)。3.D11药代动力学研究在大鼠中进行D11 50mg/kg单剂量药代动力学研究,D11在大鼠中表现出良好的绝对口服生物利用度,F值为50.63%。。在此外,D11显示出的药物半衰期和口服吸收度表明D11具有良好的口服成药性(t1/2= 3.3 h,Cmax= 313 ng/mL,AUC 0-t = 4669 ng/mL h)。4.D11缓解EAE小鼠的疾病进展在小鼠EAE造模后第8天,20%的小鼠开始出现尾梢疲软的EAE早期症状,将小鼠进行随机分组,并从此天开始对阳性药地塞米松组(10 mg/kg)和D11组(100mg/kg,200 mg/kg)进行给药,对所有造模小鼠每天打分并称重。在造模后第11天,EAE模型组小鼠临床症状打分平均达到1.7 ±0.2分,阳性药地塞米松组和D11 200 mg/kg组临床症状打分平均分别为0.3 ± 0.1分和0.5 ± 0.1分,显着低于EAE模型组(p<0.01,n=5),而D11 100mg/kg组临床症状打分平均为1.1±0.2分,低于EAE模型组,但无显着性(p>0.05,n=5)。在造模后第17天,EAE模型组小鼠临床症状打分平均到达峰值,为3.3 ±0.1分,此时阳性药地塞米松组和D11 200 mg/kg组临床症状打分平均分别为0.7 ±0.1分和1.3±0.2分,显着低于EAE模型组(p<0.001,n=5),而D11 100mg/kg组临床症状打分平均为3.1 士 0.1分,与EAE模型组相比无明显差别(p>0.05,n=5)。另一方面,EAE模型组和D11100mg/kg组小鼠在造模后体重逐渐减轻,在疾病峰期后体重回升,而阳性药地塞米松组和D11 200 mg/kg组小鼠体重相对稳定。以上结果提示,D11(200 mg/kg)治疗给药可缓解EAE发病进程,改善EAE造模小鼠的运动功能障碍,并维持EAE小鼠的体重稳定。5.D11减轻EAE小鼠脊髄中的炎性反应和髄鞘损伤HE染色结果显示,EAE小鼠疾病峰期(第17天),模型组小鼠脊髓白质区可见大量的炎性细胞浸润,而D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠脊髓中无明显炎性细胞浸润。流式细胞术检测结果显示,与EAE模型组小鼠相比,D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠中枢系统(脑+脊髓)浸润的致炎性Th1(CD4+ IFN-γ+)和Th17(CD4+IL-17+)细胞比例占辅助性T细胞(CD4+)比例显着下降(p<0.05,n=3)。LFB染色结果显示,EAE小鼠疾病峰期(第17天),模型组小鼠脊髓白质区着色浅,空泡状改变较多,提示髓鞘丢失。而D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠脊髓白质区未见空泡状改变和明显损伤。以上结果表明,D11(200 mg/kg)治疗给药可减轻EAE小鼠脊髓中的炎性反应和髓鞘损伤。6.D11可以促进EAE小鼠体内巨噬细胞M2型极化并抑制M1型极化流式细胞术检测结果显示,在疾病高峰期(造模后第13～19天),与EAE模型组小鼠相比,D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠体内外周免疫器官(脾脏和淋巴结)和中枢系统(脊髓和脑)中的M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)占巨噬细胞(F4/80+)比例显着上升(p<0.05,n=3),而M1型巨噬细胞(F4/80+CD86+)比例显着下降(p<0.05,n=3)。7.D11对EAE小鼠体内成熟树突细胞、Treg细胞未产生明显影响流式细胞术检测结果显示,在疾病高峰期(造模后第13～19天),与EAE模型组小鼠相比,D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠体内外周免疫器官(脾脏和淋巴结)和中枢系统(脊髓和脑)中成熟树突细胞(MHC-II+CD11C+)占树突细胞(CD11C+)比例、Treg细胞(CD4+Foxp3+)占辅助性T细胞(CD4+)比例均没有明显变化(p>0.05,n=3)。8.D11促进巨噬细胞M2型极化基因表达化合物D11作用巨噬细胞株Raw264.7 24h后,microarray结果表明D11能够激活多个巨噬细胞M2型极化基因并抑制多个M1型极化基因。化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs 24h后,巨噬细胞M2型基因Arg1、Mrc1和Fizz1的mRNA水平显着上调(p<0.05,n=3)。Westemblot结果表明化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs 24h后巨噬细胞M2型蛋白Arg1、Ym1表达上调。化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs24h后,M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例上升(p<0.05,n=3),在预先给予LPS刺激241h后给予D11作用24h,巨噬细胞M1型基因Mcy1、Inos、Cd86 mRNA水平显着下调(p<0.05,n=3);M1型巨噬细胞(CD86+F4/80+)在巨噬细胞中所占比例下降(p<0.05,n=3)。9.D11促进巨噬细胞AKT/STAT3信号通路激活化合物D11作用巨噬细胞株Raw264.7 24h后,KEGG信号通路分析显示D11主要影响细胞免疫和信号转导相关通路,进一步分析发现表达显着差异基因(SDE)如 Ikk,Pim-1,Amli-etc主要属于 JAK-STAT 和 PI3K-AKT 信号通路。Western blot结果显示,化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs24h后,308位点和473位点磷酸化的AKT及磷酸化STAT3均显着增强,而D11对STAT6的磷酸化则没有产生明显影响。10.敲除STAT3对巨噬细胞和树突细胞的影响分别从野生型(WT)和髓系STAT3敲除的C57BL/6小鼠(lysm cre STAT3fl/fl)中提取并培养分化BMDC细胞和BMDM细胞,流式检测结果显示,成熟的树突细胞(CD80+CD11C+)、(CD86+CD11C+)、(MHC-II+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中的比例没有明显差异(p>0.05,n=3);M1型巨噬细胞(CD86+F4/80+)和M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)占巨噬细胞(F4/80+)的比例也没有明显差异(p>0.05,n=3)。ELISA检测结果显示,STAT3敲除未对成熟树突细胞分泌的细胞因子IL-6和IL-12水平产生明显影响(p>0.05,n=3)。11.Lysm cre STAT3fl/fl小鼠造EAE模型症状减轻分别对WT和lysm cre STAT3fl/fl C57BL/6小鼠造EAE模型,从造模后第10天开始到第18天,lysmcre STAT3fl/fl组小鼠EAE临床症状打分平均显着低于EAE模型组(p<0.05,n=5),且在造模后第12天到第16天EAE模型组小鼠平均体重显着低于lysm cer STAT3fl/fl组小鼠(p<0.05,n=5)。流式细胞术检测结果显示,与EAE模型组小鼠相比,lysmCre STAT3fl/fl组小鼠中枢(脑+脊髓)浸润的致炎性Thl(CD4+IFN-γ+)细胞比例占辅助性T细胞(CD4+)比例显着下降(p<0.05,n=3)。12.Lysm cre STAT3Sfl/fl小鼠造EAE模型症状减轻机制研究流式细胞术检测结果显示,在疾病高峰期(造模后第13～16天),与lysm cre STAT3+/fl组小鼠相比,lysmcreSTAT3fl/fl组小鼠体内外周免疫器官(脾脏和淋巴结)的M1型(F4/80+CD86+)和M2型(F4/80+CD206+)巨噬细胞占巨噬细胞(F4/80+)比例均没有明显差异(P>0.05,n=3),体内外周免疫器官和中枢神经系统(脑和脊髓)中成熟树突细胞(MHC-II+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中的比例也没有明显差异(p>0.05,n=3)。13.Lysm cre STAT3073l小鼠中枢浸润M2型巨噬细胞增加流式检测结果显示在疾病高峰期(造模后第13～16天),与丨ysmcreSTAT3+/fl组小鼠相比,lysm cre STAT3fl/fl组小鼠中枢神经系统(脑和脊髓)当中外周浸润的巨噬细胞(CD11b+CD45+)中M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)占巨噬细胞(F4/80+)比例显着上升(p<0.05,n=3),M1型巨噬细胞(F4/80+CD86+)占巨噬细胞(F4/80+)比例没有明显差异(p>0.05,n=3)。小鼠中枢当中固有的巨噬细胞(CD11b+CD45int)中,M1型(F4/80+CD86+)和M2型(F4/80+CD206+)巨噬细胞占巨噬细胞(F4/80+)比例均没有明显差异(P>0.05,11=3)。研究结论:本课题发现并证实了 3,4-二取代的哌啶衍生物能够促进巨噬细胞M2型标记物Arg1表达,将其作为候选化合物对其进行结构优化最终得到了能显着促进巨噬细胞M2型极化的化合物D11。化合物D11表现出良好的口服生物利用度,并且在MS小鼠模型EAE上给予D11可以显着缓解其临床症状并伴随着小鼠体内巨噬细胞M2型极化增多而M1型极化减少。在体外原代巨噬细胞BMDM上给予D11可以显着抑制其促进CD4+ T细胞增殖的活性。该作用机制可能是通过增强AKT和STAT3的磷酸化。综上所述,本课题通过化合物库筛选和结构优化得到的小分子化合物D11能够通过促进巨噬细胞M2型极化并抑制M1型极化,从而抑制炎症的发生。(本文来源于《浙江大学》期刊2019-01-01）
程柯[3]（2018）在《四氮唑探针在表型筛选、活性导向的蛋白谱分析及肿瘤生物标志物检测中的应用》一文中研究指出表型筛选是药物研发中重要的手段,通过表型筛选可以获得大量生物学活性较好的化合物,然而这些化合物在体内的作用模式和作用靶点往往难以确证。为解决这样的困难,本课题将表型筛选结合了近年来发展的活性导向的蛋白谱分析(ABPP)方法,即通过表型筛选获得具有良好活性的化合物,并进一步利用ABPP方法确证其体内作用靶点。活性导向的蛋白谱分析(ABPP)在药物研究领域被广泛地应用于寻找与疾病相关联的新靶标、鉴定药物分子的作用靶点。其技术特点是通过引入分子探针,使药物或活性化合物与靶标蛋白质共价结合,随后进行后续分离及鉴定工作。由于多数活性分子与蛋白质之间是非共价结合,因此需要引入光亲和基团使分子探针与蛋白质在紫外光照射下形成共价键。目前常见的光亲和标记基团均存在一定的缺陷,如二苯甲酮需要较长紫外光照时间,芳基迭氮与靶标蛋白共价结合效率低于30%等。近期有研究表明2,5-二芳基四氮唑基团能在较短时间的紫外光照下、高效率地与目标蛋白共价结合。因此2,5-二芳基四氮唑基团有可能克服上述基团的缺陷,发展为新型的光亲和基团。本课题研究了不同取代基的2,5-双取代四氮唑基团作为光亲和基团,初步发现了2,5-二苯基取代的四氮唑具有最好的光亲和标记效率,并以此为基础合成了一系列四氮唑探针分子。通过对这一系列探针分子进行筛选,我们发现了一些四氮唑探针分子具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的活性。随后借助ABPP方法,我们发现并初步验证了ANXA2,FLAD1和NOS2等潜在的体内靶点。此外,本研究发现其中一个四氮唑探针分子,能在活体肿瘤细胞中专一性标记和显影膜联蛋白Ⅱ(一种肿瘤标志物)。以上这些具有活性的四氮唑分子对于肿瘤相关疾病的诊断和治疗具有潜在的价值。(本文来源于《暨南大学》期刊2018-04-01）
张爱,池泉,林授[4]（2018）在《福建地区稀有血型JK(a-b-)表型筛选及分子遗传学分析》一文中研究指出目的了解福建地区无偿献血者Kidd血型系统中JK(a-b-)表型的分布频率并分析其遗传学特征。方法用尿素溶解试验筛查福建地区180 626例无偿献血者JK(a-b-)表型;用经典血清学方法确证其表型;对JK基因的启动子、11个外显子及其侧翼区域(50~150 bp)扩增后测序并分析序列信息;用SNa Pshot技术分析福建地区200例献血者JK基因的单核苷酸多态性(SNP)。结果 180 626例无偿献血者中检出15例JK(a-b-)表型个体。分析15例JK(a-b-)表型个体JK基因,检测出的4种隐性基因分别为JK*B(IVS5-1G>A)、JK*B(896G>A)、JK*A(130G>A,220A>G)和JK*B(130G>A,956C>T),这4种隐性基因分别占检出无效基因的66.67%、23.33%、6.67%和3.33%。分析上述200例献血者JK基因SNP发现,JK*B(IVS5-1G>A)为0.75%,JK基因的G130A是一种常见的多态性,未检测到A220G、C222T、C956T、G896A变异。结论福建地区无偿献血人群中JK(a-b-)表型频率估计约为0.008%,JK*B(IVS5-1G>A)和JK*B(896G>A)是该地区JK(a-b-)表型的主要流行基因,发现1个新的引起JK(a-b-)表型的JK-null基因,即SLC14A1 130A,220G。(本文来源于《临床检验杂志》期刊2018年03期）
曾然然[5]（2017）在《基于肿瘤细胞表型筛选模型的靶向抗癌先导化合物的发现与药物作用机制研究》一文中研究指出药物创新主要经过先导化合物的发现,先导化合物的优化以及临床研究阶段。先导化合物的发现是药物创新的源头,能否发现新颖且成药性好的先导化合物,直接关系到一个药物创新项目的成败。先导化合物的发现有两种模式:基于靶标的药物筛选和基于表型的药物筛选。近年来,表型药物筛选因与疾病有紧密的关联以及更有利于一类新药的发现而受到广泛关注,并被赋予了新的内涵,即现代表型药物筛选。据一项源于Nature Reviews Drug Discovery的报道,一类新药(First-in-class drugs)的发现主要采用基于表型的药物筛选模式,并且呈递增趋势;而二类新药(Follower drugs)的发现,主要依赖于基于靶标的药物筛选模式,同样呈递增趋势。现代表型药物筛选包括基于动物、器官、组织、细胞模型的药物筛选,其研究手段不仅限于纯实验手段,还可以借助计算药物分子设计等方法。细胞水平的活性是连接靶标水平与动物水平活性的桥梁。本研究基于NCI-60癌细胞表型筛选大数据,借助机器学习方法,建立化合物的抗癌细胞活性预测模型,采用五倍交叉验证、外部验证、Y-Scrambling等方法对所建模型进行验证。同时,应用这个NCI-60抗癌细胞活性预测模型,对ChemDiv化合物数据库进行虚拟筛选。虚拟筛选得到了14个抗肿瘤先导化合物,其中活性最好的先导化合物G03在MDA-MB-231、Hela、HCT-116、HepG2、MCF-7五种细胞系上的IC50分别为2.82μM、2.90μM、2.98μM、3.20μM以及4.61μM。靶标研究对基于表型筛选得到的药物至关重要。针对活性最好的抗癌先导化合物G03,运用基于分子相似度的虚拟靶标钓取方法和SPR实验,确定G03的靶标为微管蛋白。从微管动力学、细胞内微管的稳定性、微管蛋白的乙酰化水平等多角度研究G03与微管之间的相互作用。微管对细胞周期、细胞迁移等生理过程都有重要影响,因此,很有必要研究G03对细胞周期、凋亡、迁移及侵袭的作用。第一章介绍当前主要的药物发现的策略、研究进展以及NCI-60数据库的研究进展。第二章介绍基于NCI-60抗癌细胞表型筛选的活性预测模型的构建与模型验证。第叁章介绍基于NCI-60抗癌细胞活性预测模型的先导化合物发现。第四章介绍先导化合物G03的靶标研究与药物作用机制研究。第五章为展望和总结。概述本课题研究的创新之处与课题的进一步深入研究方向。(本文来源于《华南理工大学》期刊2017-04-21）
谭晓文,董鹏志,宁召臣,朱彦[6]（2017）在《以ADP受体P2Y12为靶标的中药抗栓活性无标记细胞表型筛选》一文中研究指出[目的]建立二磷酸腺苷(ADP)受体P2Y12的无标记方法以高通量、低毒性地筛选中药抗血小板/血栓活性物质。[方法]应用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒p CMV-h P2Y12-C-His转染入HEK293细胞,采用遗传霉素(G418)筛选获得稳定转染的h P2Y12-C-His-HEK293细胞系,以实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)的方法,分别从转录和翻译水平验证P2Y12-His的表达,采用Lable-free Enspire多功能读板机检测激动剂ADP的激动作用,以及抑制剂替卡格雷的抑制作用,以确定筛选体系的可靠性,并利用该体系筛选中药活性组分及单体共30种。[结果]经PEI转染和G418筛选获得了P2Y12-His-HEK293稳转细胞株。q RT-PCR和Western Blot结果表明P2Y12-His m RNA和蛋白表达量均显着性增加。Lable-free Enspire多功能读板机检测实验表明P2Y12受体激动剂ADP,抑制剂替卡格雷,有显着的激动及抑制作用,且具有明显的量效关系。中药组分及单体筛选结果表明,有7种组分或单体对P2Y12受体具有良好的抑制作用。[结论]本实验成功建立了ADP受体P2Y12Lable-free Enspire多功能读板机的无标记高通量筛选。(本文来源于《天津中医药大学学报》期刊2017年01期）
章文,李德发,王红梅,吴跃平,曹科[7]（2015）在《深圳地区儿童Kidd血型Jk(a-b-)表型筛选及分子机理研究》一文中研究指出目的调查深圳地区人群中Jk(a-b-)表型检出率;探讨深圳地区Jk(a-b-)表型产生的分子机理。方法用尿素溶血实验筛选出Jk(a-b-)表型,采用微柱凝胶法进行Jk(a-b-)表型血清学确认试验,并对Jk(a-b-)表型标本进行DNA提取扩增及纯化测序。结果从20 453儿童标本中筛选出4例Jk(a-b-)表型,检出率为4∶20 453,分布频率为0.019 6。在对其中4名先证者基因分型中,共发现了2种基因型,纯合IVS5-1G>A,杂合IVS5-1G>A合并杂合896G>A。结论深圳地区人群中Jk(a-b-)表型分布频率明显高于国内其它地区,检测到的基因型IVS5-1G>A、杂合IVS5-1G>A合并杂合896G>A是中国人群中最常见的基因变异。(本文来源于《中国输血杂志》期刊2015年01期）
余广超,叶聪秀,陈锐忠,车玉传,刘菊珍[8]（2014）在《鲍曼不动杆菌中OXA碳青霉烯酶的表型筛选与PCR检测》一文中研究指出目的了解OXA碳青霉烯酶在暨南大学附属第一医院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中的流行状况,完善OXA碳青霉烯酶的分子流行病学资料。方法采用改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,多重PCR法检测OXA碳青霉烯酶的编码基因(blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-58-like和blaOXA-143),利用生物信息学的方法对OXA亚型进行比对分析并制作分子进化树。结果在157株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中Hodge试验筛选出碳青霉烯酶表型阳性菌株141株,PCR检测结果显示有132株携带OXA-23编码基因,未检测到OXA-24-like、OXA-58-like和OXA-143亚型。结论产OXA-23碳青霉烯酶是该院鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的主要机制之一。(本文来源于《中国微生态学杂志》期刊2014年12期）
尚锦青,贾雯婷,苏仁娜[9]（2014）在《内蒙古呼和浩特地区献血人群Jk(a-b-)表型筛选分析》一文中研究指出目的了解内蒙古呼和浩特地区无偿献血者人群中,Kidd血型系统中Jk(a—b-)稀有血型的分布特点。方法对22 309名无偿献血者标本,用96孔微量板法2 mol/L尿素溶血试验进行筛选;再用试管法尿素溶血试验进行确证;然后用试管法间接抗球蛋白试验(IAT)对筛选到的Jk(a—b-)进行血型血清学定型,并用已知的Jk(a+b-)和JK(a—b+)作对照。结果在22 309名无偿献血者中共筛选到1名Jk(a—b-)血型个体,其分布频率为0.0044%。结论(本文来源于《中国输血协会第七届输血大会论文专辑（摘要篇）》期刊2014-11-13）
徐筱杰,陈丽蓉,古江勇,罗芳[10]（2014）在《基于细胞的药物表型筛选及表型组学的计算研究》一文中研究指出近年来基于动物、器官、组织、细胞的表型筛选因与疾病有紧密的关联及更利于一类新药的发现而受到广泛关注。基于细胞的表型筛选在保持合理的实验效率的同时,还体现了疾病相关生物途径及其相互作用的系统特征。因此细胞的表型筛选,特别是最近发展的针对细胞特定功能的生物途径的筛选策略将成为有前景及重要的药物筛选途径。人类表型组学是研究人类的所有表型性状,表型间的关联及表型与不同疾病之间的关系。表型组学的目的是利用新型高通量计算和信息学技术推导基因型-表型关联及全基因组分子网络。目前一个清晰的趋势是人类疾病机制的研究已开始从遗传学向表型组学转移。近年来我们课题组发展了针对细胞多种特定功能的生物途径的药效及药物分子间的协同或拮抗作用的计算评估方法。目前我们也在发展关联不同细胞表型及表型与疾病关系的计算方法。(本文来源于《中国化学会第29届学术年会摘要集——第19分会：化学信息学与化学计量学》期刊2014-08-04）
表型筛选论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究目的:多发性硬化症(Multiple Sclerosis,MS)是临床常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病,其病理进程可引起脑和脊髓的损伤进而严重影响患者的生存质量。目前临床上采取的治疗手段如免疫调节剂芬戈莫德只能在一定程度上延缓疾病进展,无法从根本上修复受损髓鞘和预防炎症。M1型极化的巨噬细胞分泌炎性因子导致炎症的发生,而M2型极化的巨噬细胞则有利于髓鞘和轴突的修复,并有抑制炎症的作用,从而兼具髓鞘修复和免疫调控的作用。本课题通过实验室内部的化合物库筛选得到促进巨噬细胞M2型极化的新型化合物骨架结构,并对这种化合物骨架进行结构优化,研究其对多发性硬化症的治疗作用和分子机制。研究方法:1.调控巨噬细胞极化的化合物筛选:1)RAW264.7小鼠巨噬细胞株给予具有不同骨架的化合物,单独作用24h采用qRT-PCR检测巨噬细胞M2型基因Arg1和M1型基因Mcp1的mRNA变化水平;2)RAW264.7小鼠巨噬细胞株预先用LPS刺激24h后给予具有不同骨架的化合物作用24h,采用qRT-PCR检测巨噬细胞M1型基因Mcp1的mRNA变化水平;3)原代巨噬细胞(Bone Marrow Derived Macrophages,BMDMs)经筛选及优化得到的D11作用24h后,采用qRT-PCR检测巨噬细胞M2型基因Arg,Mrc1和Fizz1及M1型基因Inos,Mcp1和Cd86的mRNA变化水平,采用流式细胞术检测M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例;4)BMDMs预先用LPS刺激24h后,给予D11作用24h,采用qRT-PCR检测巨噬细胞M1型基因Inos,Mcp1和Cd86的mRNA变化水平,采用流式细胞术检测M1型巨噬细胞(CD86+F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例。2.D11对树突细胞成熟和CD4+T细胞增殖分化的影响:1)采用流式细胞术检测BMDCs经D11作用24h和对照组成熟的树突细胞(MHC-Ⅱ+CD11C+)和(CD80+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例;2)采用IL-6和IL-12 ELISA检测试剂盒检测BMDCs经D11作用24h后和对照组细胞培养液中的IL-6和IL-12水平;3)用naive CD4+ T细胞分离试剂盒从C57BL/6小鼠淋巴结中分离幼稚CD4+ T细胞,加入anti-CD3(11g/ml),anti-CD28(5 μg/ml),在1640培养基+10%FBS中培养72h,在最后24h加入D11,流式检测Th1诱导条件下(IL-121 μg/ml)Th1细胞(CD4+ IFN-γ+)占CD4+T细胞的比例及Th17诱导条件下(IL-6 2.5 ng/ml、TGF-β 1 ng/ml)Th17 细胞(CD4+ IL-17+)占 CD4+T细胞的比例;4)BMDMs经D11作用24h后与经CFSE标记的CD4+ T细胞共培养48h,流式检测增殖的CD4+T细胞占CD4+细胞的比例。3.D11药代动力学研究:选择检疫合格SD大鼠8只(雌雄各半),分成2组,即D11灌胃组和D11静脉注射组,每组4只SD大鼠,雌雄各半。灌胃组于灌胃前和灌胃后10min、30min、lh、2h、3h、4h、8h、24h和48h分别尾静脉取血,每只动物每次采血量不多于0.2 ml。静注组于给药前和给药后5 min、15 min、30 min、1h、2 h、4 h、8 h、24h和48h分别取血,每只动物每次采血量不多于0.2ml。取血浆样品,加入3倍量含内标0.20 μg/ml的甲醇液沉淀蛋白,涡漩10 min,10000 r/min离心10 min,取上清液进样分析。LC-MS分析采用正离子方式检测。将所得浓度-时间数据,用DAS 3.0药代动力学软件,采用统计矩法进行计算,得到大鼠灌胃和静注给予D11后主要吸收动力学参数AUC(0-t)、AUC(0-∞)Cmax、Tmax等。4.D11对MS小鼠模型EAE的治疗作用及机制研究:选择检疫合格C57BL/6小鼠,使用MOG35_55诱导经典的MS小鼠模型EAE,从造模第8天开始,每天1天,连续19天灌胃给于不同剂量的D11。1)采用Kono's法每天对各组EAE造模小鼠的临床症状打分,并每天记录各组小鼠的体重变化;2)采用苏木精-伊红(Hematoxy1in&Erosin,HE)和坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色评价D11对小鼠脊髓炎性和髓鞘损伤的保护作用;3)采用流式细胞术检测EAE小鼠体内Th1细胞(CD4+IFN-γ+)和Th17细胞(CD4+ IL-17+)占CD4+T细胞的比例;4)采用流式细胞术检测小鼠体内M1(CD86+F4/80+)型和M2型(CD206+F4/80+)巨噬细胞在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例;5)采用流式细胞术检测小鼠体内成熟的树突细胞(MHC-II+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例;6)采用流式细胞术检测小鼠体内Treg细胞(CD4+FOXP3+)占CD4+T细胞的比例。5.D11促进巨噬细胞M2型极化机制研究:1)采用基因芯片技术(microarray)分析D11给药和对照组的巨噬细胞基因组表达水平;2)采用Western Blot技术检测D11给药后STAT3,AKT和STAT6的激活情况;3)采用流式细胞术检测LysmcreSTAT3+fl小鼠和LysmcreSTAT3fl/fl小鼠来源BMDMs的M1和M2型分别在巨噬细胞中所占比例;4)采用流式细胞术检测Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠来源BMDCs成熟的树突细胞在树突细胞中所占比例;5)采用IL-6和IL-12 ELISA检测试剂盒检测Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STATH3fl/fl小鼠来源BMDCs细胞培养液中的IL-6和IL-12水平;6)对Lysm cre STAT3+/fl小鼠和Lysm cre STAT3fl/fl小鼠进行EAE造模,每日进行临床症状打分,并每天记录两组小鼠的体重变化;7)采用流式细胞术检测小鼠体内M1型和M2型巨噬细胞在巨噬细胞中所占比例及成熟的树突细胞在树突细胞中所占比例;8)采用流式细胞术检测小鼠中枢免疫器官中外周浸润巨噬细胞(CD45hi CD11bhi)和小胶质细胞(CD45intCD11bhi)M1型和M2型所占比例。研究结果:1.调控巨噬细胞极化的化合物筛选28种具有代表性的结构骨架化合物(S-1～S-28)分别作用Raw264.7 24h后,S-2、S-9、S-11、S-28可显着促进巨噬细胞M2型基因Arg1mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:S-2:7.3 倍、S-9:8.1 倍、S-11:7.0 倍、S-28:10.1 倍),S-9、S-13、S-16、S-18可显着促进巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:S-9:3.3 倍、S-13:3.0 倍、S-16:2.7 倍、S-18:3.5 倍)。基于相似性从 Molport数据库搜索得到的S-28结构类似物(A1～A10)分别作用Raw264.7 24h后,A2可显着促进巨噬细胞M2型基因Arg1 mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:A2:4.9倍)但作用弱于S-28,巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA表达无明显变化(p>0.05,n=3)。S-28的手性化合物B1作用Raw264.7 24h后,巨噬细胞M2型基因Arg1,M1型基因Mcp1 mRNA表达无明显变化(p>0.05,n=3)。S-28的a-b环及c-d环结构类似物(C1～C11)分别作用Raw264.7 24h后,巨噬细胞M2型基因Arg1,M1型基因Mcp1mRNA表达无明显变化(p>0.05,n=3)。S-28的不同取代基化合物(DI～D21)分别作用Raw264.7 24h后,D8、D9、D10、D11、D12、D13、D15可显着促进巨噬细胞M2型基因Arg1mRNA表达(p<0.05,n=3,上调倍数:D8:10.1 倍、D9:8.4 倍、D10:6.5 倍、D11:14.0 倍、D12:10.1倍、D13:5.1倍、D15:10.3倍),D14、D15、D16可显着促进巨噬细胞M1型基因Mcp1mRNA 表达(p<0.05,n=3,上调倍数:D14:4.85 倍、D15:3.54 倍、D16:5.08倍)。2.D11对树突细胞成熟和CD4+ T细胞增殖分化的影响流式检测结果显示,化合物D11作用原代树突细胞BMDCs24h后,分化成熟的树突细胞(CD80+CD11C+)、(MHC-Ⅱ+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中所占比例没有发生明显变化(p>0.05,n=3)。ELISA结果显示,成熟树突细胞分泌的细胞因子IL-6和IL-12在D11给药后也没有发生明显变化(p>0.05,n=3)。化合物 D11 作用 CD4+T 细胞 24h,CD4+T 细胞分化成 Th1(CD4+IFN-γ+)和 Th17(CD4+IL-17+)均没有明显受到药物的影响(p>0.05,n=3)。BMDMs经D11作用24h后与经CFSE标记的CD4+T细胞共培养48h,增殖的CD4+T细胞占总CD4+细胞的比例显着降低(p<0.05,n=3)。且CD4+ T细胞和BMDMs共培养的上清液中炎性因子IFN-γ和IL-17的浓度显着降低(p<0.05,n=3)。3.D11药代动力学研究在大鼠中进行D11 50mg/kg单剂量药代动力学研究,D11在大鼠中表现出良好的绝对口服生物利用度,F值为50.63%。。在此外,D11显示出的药物半衰期和口服吸收度表明D11具有良好的口服成药性(t1/2= 3.3 h,Cmax= 313 ng/mL,AUC 0-t = 4669 ng/mL h)。4.D11缓解EAE小鼠的疾病进展在小鼠EAE造模后第8天,20%的小鼠开始出现尾梢疲软的EAE早期症状,将小鼠进行随机分组,并从此天开始对阳性药地塞米松组(10 mg/kg)和D11组(100mg/kg,200 mg/kg)进行给药,对所有造模小鼠每天打分并称重。在造模后第11天,EAE模型组小鼠临床症状打分平均达到1.7 ±0.2分,阳性药地塞米松组和D11 200 mg/kg组临床症状打分平均分别为0.3 ± 0.1分和0.5 ± 0.1分,显着低于EAE模型组(p<0.01,n=5),而D11 100mg/kg组临床症状打分平均为1.1±0.2分,低于EAE模型组,但无显着性(p>0.05,n=5)。在造模后第17天,EAE模型组小鼠临床症状打分平均到达峰值,为3.3 ±0.1分,此时阳性药地塞米松组和D11 200 mg/kg组临床症状打分平均分别为0.7 ±0.1分和1.3±0.2分,显着低于EAE模型组(p<0.001,n=5),而D11 100mg/kg组临床症状打分平均为3.1 士 0.1分,与EAE模型组相比无明显差别(p>0.05,n=5)。另一方面,EAE模型组和D11100mg/kg组小鼠在造模后体重逐渐减轻,在疾病峰期后体重回升,而阳性药地塞米松组和D11 200 mg/kg组小鼠体重相对稳定。以上结果提示,D11(200 mg/kg)治疗给药可缓解EAE发病进程,改善EAE造模小鼠的运动功能障碍,并维持EAE小鼠的体重稳定。5.D11减轻EAE小鼠脊髄中的炎性反应和髄鞘损伤HE染色结果显示,EAE小鼠疾病峰期(第17天),模型组小鼠脊髓白质区可见大量的炎性细胞浸润,而D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠脊髓中无明显炎性细胞浸润。流式细胞术检测结果显示,与EAE模型组小鼠相比,D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠中枢系统(脑+脊髓)浸润的致炎性Th1(CD4+ IFN-γ+)和Th17(CD4+IL-17+)细胞比例占辅助性T细胞(CD4+)比例显着下降(p<0.05,n=3)。LFB染色结果显示,EAE小鼠疾病峰期(第17天),模型组小鼠脊髓白质区着色浅,空泡状改变较多,提示髓鞘丢失。而D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠脊髓白质区未见空泡状改变和明显损伤。以上结果表明,D11(200 mg/kg)治疗给药可减轻EAE小鼠脊髓中的炎性反应和髓鞘损伤。6.D11可以促进EAE小鼠体内巨噬细胞M2型极化并抑制M1型极化流式细胞术检测结果显示,在疾病高峰期(造模后第13～19天),与EAE模型组小鼠相比,D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠体内外周免疫器官(脾脏和淋巴结)和中枢系统(脊髓和脑)中的M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)占巨噬细胞(F4/80+)比例显着上升(p<0.05,n=3),而M1型巨噬细胞(F4/80+CD86+)比例显着下降(p<0.05,n=3)。7.D11对EAE小鼠体内成熟树突细胞、Treg细胞未产生明显影响流式细胞术检测结果显示,在疾病高峰期(造模后第13～19天),与EAE模型组小鼠相比,D11(200 mg/kg)治疗给药组小鼠体内外周免疫器官(脾脏和淋巴结)和中枢系统(脊髓和脑)中成熟树突细胞(MHC-II+CD11C+)占树突细胞(CD11C+)比例、Treg细胞(CD4+Foxp3+)占辅助性T细胞(CD4+)比例均没有明显变化(p>0.05,n=3)。8.D11促进巨噬细胞M2型极化基因表达化合物D11作用巨噬细胞株Raw264.7 24h后,microarray结果表明D11能够激活多个巨噬细胞M2型极化基因并抑制多个M1型极化基因。化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs 24h后,巨噬细胞M2型基因Arg1、Mrc1和Fizz1的mRNA水平显着上调(p<0.05,n=3)。Westemblot结果表明化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs 24h后巨噬细胞M2型蛋白Arg1、Ym1表达上调。化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs24h后,M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)在巨噬细胞(F4/80+)中所占比例上升(p<0.05,n=3),在预先给予LPS刺激241h后给予D11作用24h,巨噬细胞M1型基因Mcy1、Inos、Cd86 mRNA水平显着下调(p<0.05,n=3);M1型巨噬细胞(CD86+F4/80+)在巨噬细胞中所占比例下降(p<0.05,n=3)。9.D11促进巨噬细胞AKT/STAT3信号通路激活化合物D11作用巨噬细胞株Raw264.7 24h后,KEGG信号通路分析显示D11主要影响细胞免疫和信号转导相关通路,进一步分析发现表达显着差异基因(SDE)如 Ikk,Pim-1,Amli-etc主要属于 JAK-STAT 和 PI3K-AKT 信号通路。Western blot结果显示,化合物D11作用原代巨噬细胞BMDMs24h后,308位点和473位点磷酸化的AKT及磷酸化STAT3均显着增强,而D11对STAT6的磷酸化则没有产生明显影响。10.敲除STAT3对巨噬细胞和树突细胞的影响分别从野生型(WT)和髓系STAT3敲除的C57BL/6小鼠(lysm cre STAT3fl/fl)中提取并培养分化BMDC细胞和BMDM细胞,流式检测结果显示,成熟的树突细胞(CD80+CD11C+)、(CD86+CD11C+)、(MHC-II+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中的比例没有明显差异(p>0.05,n=3);M1型巨噬细胞(CD86+F4/80+)和M2型巨噬细胞(CD206+F4/80+)占巨噬细胞(F4/80+)的比例也没有明显差异(p>0.05,n=3)。ELISA检测结果显示,STAT3敲除未对成熟树突细胞分泌的细胞因子IL-6和IL-12水平产生明显影响(p>0.05,n=3)。11.Lysm cre STAT3fl/fl小鼠造EAE模型症状减轻分别对WT和lysm cre STAT3fl/fl C57BL/6小鼠造EAE模型,从造模后第10天开始到第18天,lysmcre STAT3fl/fl组小鼠EAE临床症状打分平均显着低于EAE模型组(p<0.05,n=5),且在造模后第12天到第16天EAE模型组小鼠平均体重显着低于lysm cer STAT3fl/fl组小鼠(p<0.05,n=5)。流式细胞术检测结果显示,与EAE模型组小鼠相比,lysmCre STAT3fl/fl组小鼠中枢(脑+脊髓)浸润的致炎性Thl(CD4+IFN-γ+)细胞比例占辅助性T细胞(CD4+)比例显着下降(p<0.05,n=3)。12.Lysm cre STAT3Sfl/fl小鼠造EAE模型症状减轻机制研究流式细胞术检测结果显示,在疾病高峰期(造模后第13～16天),与lysm cre STAT3+/fl组小鼠相比,lysmcreSTAT3fl/fl组小鼠体内外周免疫器官(脾脏和淋巴结)的M1型(F4/80+CD86+)和M2型(F4/80+CD206+)巨噬细胞占巨噬细胞(F4/80+)比例均没有明显差异(P>0.05,n=3),体内外周免疫器官和中枢神经系统(脑和脊髓)中成熟树突细胞(MHC-II+CD11C+)在树突细胞(CD11C+)中的比例也没有明显差异(p>0.05,n=3)。13.Lysm cre STAT3073l小鼠中枢浸润M2型巨噬细胞增加流式检测结果显示在疾病高峰期(造模后第13～16天),与丨ysmcreSTAT3+/fl组小鼠相比,lysm cre STAT3fl/fl组小鼠中枢神经系统(脑和脊髓)当中外周浸润的巨噬细胞(CD11b+CD45+)中M2型巨噬细胞(F4/80+CD206+)占巨噬细胞(F4/80+)比例显着上升(p<0.05,n=3),M1型巨噬细胞(F4/80+CD86+)占巨噬细胞(F4/80+)比例没有明显差异(p>0.05,n=3)。小鼠中枢当中固有的巨噬细胞(CD11b+CD45int)中,M1型(F4/80+CD86+)和M2型(F4/80+CD206+)巨噬细胞占巨噬细胞(F4/80+)比例均没有明显差异(P>0.05,11=3)。研究结论:本课题发现并证实了 3,4-二取代的哌啶衍生物能够促进巨噬细胞M2型标记物Arg1表达,将其作为候选化合物对其进行结构优化最终得到了能显着促进巨噬细胞M2型极化的化合物D11。化合物D11表现出良好的口服生物利用度,并且在MS小鼠模型EAE上给予D11可以显着缓解其临床症状并伴随着小鼠体内巨噬细胞M2型极化增多而M1型极化减少。在体外原代巨噬细胞BMDM上给予D11可以显着抑制其促进CD4+ T细胞增殖的活性。该作用机制可能是通过增强AKT和STAT3的磷酸化。综上所述,本课题通过化合物库筛选和结构优化得到的小分子化合物D11能够通过促进巨噬细胞M2型极化并抑制M1型极化,从而抑制炎症的发生。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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