MSCs载BMP7基因表达对缺氧再给氧肾小管上皮细胞保护作用的研究

论文摘要

背景缺血再灌注损伤（ischemical reperfusion injury, IRI）导致的缺血性急性肾功能衰竭（ ischemic acute renal failure, IARF）是肾移植中影响移植肾早期功能恢复的主要因素之一。肾移植和某些疾病的发展及治疗会不同程度的影响肾脏血流,当血流再灌注后经多因素介导,通过多种途径造成肾小管、肾小球等组织结构损伤,损害肾功能,因此,作为逆转或修复损伤的治疗手段,干细胞移植和基因治疗已应用于缺血再灌注损伤防治的基础及临床研究中。干细胞治疗是代表组织再生和修复革新性的治疗技术。骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMD-MSCs）遗传背景稳定,免疫原性低,移植体内可调节免疫功能,适合同种异体移植,凭借以下优势为多种肾脏疾病的治疗带来了新的希望:一、较强的可塑性,具有高度自我更新和多向分化潜能,能跨系统或胚层分化为多种细胞,是一种可以广泛应用的组织工程细胞;二、靶向迁移特性,可感受局部微环境信号变化,迁移、定居于肿瘤、炎症、损伤等区域,是一种理想的载体细胞;三、取材方便,易于体外分离、纯化、扩增,并能保持细胞表型和多系分化潜能不变,在体内、外适宜的信号刺激与诱导下可分化为研究所需的细胞。缺血再灌注致急性肾功能衰竭,损伤较重,大量肾小管上皮细胞凋亡或坏死,肾小管结构消失,组织纤维化,而可以逆转这一过程的骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein7,BMP7）具有治疗效果。BMP7是维持胚胎期肾脏正常发育的重要因子,可通过抑制上皮细胞向间质细胞转化（epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）,促进间质细胞向上皮细胞转化（mesenchymal-to-epithelial transition,MET）等机制,对肾脏损伤有保护作用。在多种肾脏疾病模型中BMP7表达减少或缺如,经静脉给予BMP7可起治疗作用。目的作为hBMP7基因修饰MSCs移植防治肾脏缺血再灌注损伤课题的前期研究,模拟体内缺血再灌注损伤,建立人肾近曲小管上皮细胞缺氧再给氧模型,观测给予重组腺病毒介导hBMP7基因转染后的MSCs培养液对细胞缺氧再给氧损伤是否有保护作用。方法第一部分:取兔骨髓,经密度梯度离心联合贴壁法分离、培养原代MSCs,经倒置相差显微镜、透射电镜观察,绘制生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期,观测所获细胞的生物学特性。通过体外诱导分化对所获细胞是否具有多向分化潜能进行鉴定。第二部分:将构建的穿梭质粒pDC316-hBMP7,经脂质体介导与骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒载体Ad-hBMP7。对Ad-hBMP7进行鉴定。测定病毒滴度、最适感染复数和相应转染率后,通过RT-PCR检测hBMP7mRNA水平表达,通过Western blotting、免疫细胞化学染色、ELISA检测hBMP7蛋白在细胞内和培养液中的表达。第三部分:将体外培养的人肾近曲小管上皮细胞分为四组:A组,正常培养组;B组:缺氧再给氧组;C组:缺氧,再给氧+转染hBMP7基因的MSCs培养液处理组;D组:缺氧,再给氧+未转染hBMP7基因的MSCs培养液处理组。MTT比色法、流式细胞仪测定细胞损伤及修复情况。黄嘌呤氧化酶法测定总SOD活力,硫代巴比妥酸法测定MDA含量,反映各组细胞抗氧化能力及脂质过氧化程度的变化。通过免疫细胞化学染色检测各组细胞Bcl-2的表达变化。结果1.倒置相差显微镜观察所获细胞为梭形成纤维细胞样细胞,长满瓶底时呈漩涡状、辐射状排列。原代培养需要10～12d,传代培养需要7～8d。培养至3代以上细胞形态均一,生长状态良好,适合体内移植和体外使用。透射电镜观察第3代细胞合成代谢旺盛。生长曲线显示传代细胞具有相似的生长特点。流式细胞仪分析细胞周期显示大多数细胞处于静止期与DNA合成前期,只有少数细胞处于活跃的增殖期。第3代细胞经诱导培养液体外培养不同时间后,通过鉴定已向成脂肪细胞或成骨细胞分化。2.重组腺病毒载体Ad-hBMP7构建后,经鉴定该载体携带hBMP7基因,感染细胞后表达hBMP7,并可向培养液中分泌该蛋白。经扩增和纯化,测定感染性滴度为7.94×1010IU/ml。最适感染复数为100,转染率可达90%以上。转染兔MSCs后24h,即可检测到hBMP7mRNA表达,细胞内和培养液中hBMP7表达阳性。3.缺氧再给氧不同时间,MTT比色法检测显示B、C、D组活细胞减少;与B组相比,C、D组活细胞增多,细胞相对死亡率降低,而C组比D组活细胞更多,细胞相对死亡率更低。缺氧再给氧4h,FCM检测C、D组比B组凋亡或坏死细胞百分率降低,而C组比D组更低。C、D组总SOD活力较B组升高,而C组比D组更高;C、D组MDA含量较B组降低,而C组比D组更低。缺氧再给氧后,细胞Bcl-2蛋白表达阳性,Bcl-2蛋白表达量C、D组较B组高,而C组比D组更高。结论1.密度梯度离心联合贴壁法可在体外大量扩增,纯化兔骨髓间充质干细胞。所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能等干细胞生物学特性。2.成功构建重组腺病毒载体Ad-hBMP7,病毒滴度较高,可高效转染兔MSCs。转染后细胞内表达的hBMP7可向培养液中分泌。3. MSCs培养液对缺氧再给氧损伤的人肾近曲小管上皮细胞有保护作用,可能与MSCs分泌某些保护性物质有关;而载hBMP7基因的MSCs培养液对缺氧再给氧损伤的人肾近曲小管上皮细胞的保护作用更为明显,除MSCs分泌某些保护性物质外,hBMP7具有明显的保护作用,可能是通过提高细胞抗氧化能力,减轻细胞脂质过氧化损伤,促进细胞增殖,抑制细胞坏死或凋亡等途径来实现的。

论文目录

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• 中文摘要
• 论文正文 MSCs 载BMP7 基因表达对缺氧再给氧肾小管上皮细胞保护作用的研究
• 前言
• 第一部分 兔骨髓间充质干细胞分离、纯化培养和体外诱导分化鉴定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 hBMP7 基因转染兔骨髓间充质干细胞后hBMP7 体外表达
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 hBMP7 基因转染兔骨髓间充质干细胞体外表达hBMP7 对缺氧再给氧人肾近曲小管上皮细胞的保护作用
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 附图
• 参考文献
• 文献综述 载BMP7 基因骨髓间充质干细胞移植防治肾脏缺血再灌注损伤的研究进展
• 参考文献
• 硕士研究生期间发表的论文