酶解干酪素生产酪蛋白糖巨肽工艺研究

论文摘要

酪蛋白巨肽（Casein Glycomacropeptide, CGMP）是一种由凝乳酶（或胃蛋白酶）水解酪蛋白中K-casein的Phe105-Met106的肽键得到的具有64个氨基酸残基的短肽。CGMP具有多种生物活性。目前酪蛋白糖巨肽的生产主要是从乳清中提取,由于乳清中乳糖、乳清蛋白等的存在,使大规模生产CGMP存在一定的技术困难。本文以干酪素为原料,从干酪素的溶解、凝乳酶酶解条件、CGMP的初提、精制以及产品的成分测定等方面,研究了凝乳酶酶解干酪素制备CGMP的工艺。通过研究氢氧化钠浓度,干酪素溶解量与CGMP得率的关系,得到最佳的溶解条件为：氢氧化钠浓度0.16mol/L,干酪素的溶解量为6g/100mL。结合单因素实验结果,采用Minitab软件进行实验设计,对影响酶解的主要因素进行了筛选,结果表明酶解的时间、温度、pH、酶与底物比是影响酶解的主因素。根据Minitab的分析结果,采用Design Expert软件中响应面设计及分析对酶解主因素进行了优化,得到的最佳酶解条件为：酶解时间80min、酶解温度42.5℃、酶解pH6.28、酶与底物比270U/g。此时酪蛋白糖巨肽的得率为17.91mg/g干酪素。在酪蛋白糖巨肽的分离纯化部分,考察了不同絮凝剂在CGMP初提中的效果、絮凝法与等电点沉淀法的优劣、超滤的最佳条件、离子交换树脂的最佳条件等。结果表明壳聚糖、硫酸铝钾、硫酸铝等三种絮凝剂的絮凝效果较好,但不如等电点沉淀法；超滤的单因素实验表明,超滤的最佳条件是：压力0.276Mpa、转速400r/min、样品pH7.5。筛选的阴离子交换树脂D280对CGMP的分离效果较好,适合工业化生产。通过离子交换树脂的吸附及洗脱条件研究,确立其最适的分离条件为：进样体积1/10BV（柱床体积）,样品pH7.5,采用0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱,洗脱速度1BV/h,各梯度洗脱体积2BV,CGMP被洗脱的NaCl溶液浓度为0.5mol/L。SDS-PAGE检测结果表明,洗脱液中CGMP的条带单一,洗脱效果较好。经过喷雾干燥法制得3种不同纯度的CGMP样品,根据国家标准,测定样品相关理化指标。结果表明CGMP样品的糖基化度和纯度较高,符合产品的卫生指标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 酪蛋白糖巨肽简介
• 1.1.1 酪蛋白糖巨肽结构
• 1.1.2 酪蛋白糖巨肽的功能
• 1.2 酪蛋白糖巨肽的制备
• 1.2.1 直接提取法
• 1.2.2 基因重组法
• 1.2.3 酶解法
• 1.3 酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法
• 1.3.1 沉淀法
• 1.3.2 絮凝剂沉淀
• 1.3.3 膜分离法
• 1.3.4 层析法
• 1.4 本课题的研究意义和研究内容
• 1.4.1 本课题的研究目的和意义
• 1.4.2 本课题研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要药品及试剂
• 2.1.2 主要仪器及设备
• 2.1.3 主要试剂的配制
• 2.2 凝乳酶活力的测定
• 2.3 凝乳酶酶解制备酪蛋白糖巨肽
• 2.3.1 酶解方法
• 2.3.2 水解产物中酪蛋白糖巨肽的鉴定
• 2.3.3 水解液中酪蛋白糖巨肽含量的测定
• 2.3.4 水解液中蛋白含量的测定
• 2.4 干酪素溶解条件的确定
• 2.5 凝乳酶酶解制备糖巨肽条件的优化
• 2.5.1 酶解条件的单因素确定
• 2.5.2 酶解条件的主因素筛选
• 2.5.3 响应面对酶解条件的优化
• 2.6 酪蛋白糖巨肽的初步分离纯化
• 2.6.1 离心条件对初步分离纯化的影响
• 2.6.2 絮凝剂在CGMP的初步分离纯化中的应用
• 2.7 膜分离在酪蛋白糖巨肽生产中的应用研究
• 2.7.1 超滤膜浓缩
• 2.7.2 中空纤维浓缩
• 2.8 离子交换树脂在CGMP精制中的应用
• 2.8.1 离子交换树脂的预处理
• 2.8.2 离子交换树脂的筛选
• 2.8.3 不同条件对静态吸附及解吸附的影响
• 2.8.4 动态吸附曲线的绘制
• 2.8.5 洗脱条件的确定
• 2.9 产品制备及指标测定
• 2.9.1 产品制备流程
• 2.9.2 产品的理化指标测定
• 2.9.3 产品中CGMP纯度等的测定
• 3 结果与讨论
• 3.1 凝乳酶活力的测定
• 3.2 标准曲线的绘制
• 3.2.1 CGMP标准曲线的绘制
• 3.2.2 牛血清白蛋白标准曲线的绘制
• 3.3 干酪素溶解条件
• 3.4 酶解条件的优化
• 3.4.1 单因素实验
• 3.4.2 酶解条件中主因素的筛选
• 3.4.3 响应面优化酶解条件
• 3.4.4 小结
• 3.5 酪蛋白糖巨肽的初步分离纯化
• 3.5.1 离心条件对初步分离纯化的影响
• 3.5.2 絮凝剂对CGMP的初步分离纯化
• 3.5.3 絮凝剂添加量的确定
• 3.5.4 等电点沉淀与絮凝剂沉淀的比较
• 3.5.5 小结
• 3.6 膜分离在酪蛋白糖巨肽分离纯化中的应用
• 3.6.1 超滤膜浓缩
• 3.6.2 中空纤维在分离纯化中的应用
• 3.6.3 小结
• 3.7 离子交换树脂在CGMP精制中的应用
• 3.7.1 离子交换树脂的筛选
• 3.7.2 不同条件对D280静态吸附及解析附的影响
• 3.7.3 动态吸附曲线的绘制
• 3.7.4 洗脱条件的确定
• 3.7.5 小结
• 3.8 制备CGMP产品
• 3.8.1 产品制备及指标测定
• 3.8.2 小结
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢