整合素连接激酶（ILK）在视网膜新生血管疾病中的作用研究

论文摘要

合并视网膜新生血管性的疾病是世界主要的致盲原因,包括糖尿病性视网膜病变（DRP）、视网膜静脉阻塞、早产儿视网膜病变和特发性视网膜血管炎（Eales病）等多种疾病。其基本病理过程是原发病造成的视网膜血管损伤和视网膜组织缺血,并可诱发视网膜新生血管生成。结构和功能不良的新生血管以及纤维血管增生膜随之引起黄斑水肿、视网膜和玻璃体内出血、对视网膜施加牵拉最终可形成视网膜脱离,损害患者的视力,甚至导致失明。在促血管生成因子中,血管内皮生长因子（VEGF）是已发现的作用最强的血管生成分子,在它的作用下,视网膜血管内皮细胞增生,形成新生血管。抗VEGF疗法（anti-VEGF,如Bevacizumab,商品名Avastin）的应用是继激光光凝和玻璃体手术后的一个治疗视网膜新生血管的新方法。但是它并不能完全抑制新生血管的发生。在视网膜血管生成中,各种促血管生成和抑制血管生成的因子的平衡是关键,众多的血管作用因子在视网膜新生血管生成中发挥作用。近年的研究显示整合素连接激酶（ILK）参与了肿瘤生长和新生血管生成过程。视网膜色素上皮细胞（RPE）是一种有紧密连接、参与视网膜外屏障、保持视网膜功能的特化细胞,也已知通过分泌如缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、VEGF和色素上皮衍生因子（PEDF）参加许多病理过程,而这几种分子都是与视网膜新生血管有关的重要分子。ILK是细胞内的一种苏氨酸/丝氨酸（Thr/Ser）激酶,以它的COOH端与跨膜蛋白整合素的β1,β3结合,介导细胞外基质蛋白的信号传递。它是磷脂酰肌醇（-3）激酶（Pi3K）的作用底物,是蛋白激酶B（PKB/Akt）和糖原合成酶激酶3（GSK-3）重要的上游激酶。ILK连接整合素到肌动蛋白细胞骨架,转导从整合蛋白到细胞外基质和各种亚细胞成分的信号以及从细胞外环境到细胞内的信号。它与整合素和生长因子结合,参与了贴壁细胞的生长、增殖、移行,在肿瘤组织中高表达,抑制其活性能减弱肿瘤的侵袭和血管生成。然而在视网膜的新生血管发生过程中是不是同时也有ILK的参与,它和已知的血管生成因子之间的关系如何是我们感兴趣的问题。本实验的目的就是检测ILK在视网膜新生血管的表达,研究ILK在新生血管疾病中可能的作用,期望为治疗视网膜新生血管性疾病提供新的思路。目的1.检测增生性糖尿病视网膜病变（PDR）新生血管膜中的血管内皮细胞的数量以及HIF-1α、VEGF、ILK的表达,观察应用玻璃体内注射Avastin后对其的影响,以了解ILK是否参与了DRP的病理过程。2.检测高糖和缺氧条件下分别诱导的视网膜色素上皮细胞ILK和ICAM-1的表达,以了解RPE是否也能表达ILK和ICAM-1,并参与糖尿病性视网膜病变的病理过程。3.检测氧致视网膜新生血管的小鼠模型眼内ILK的表达,以了解ILK是否也是参与的分子之一。方法1.玻璃体切除术中取出的24例PDR患者的视网膜前新生血管膜,其中术前玻璃体内注射Avastin者12例,未使用Avastin治疗者12例;以10例增生性玻璃体视网膜病变（PVR）的视网膜前增生膜作为对照。HE染色计数增殖膜内的血管内皮细胞数量,免疫组织化学染色检测新生血管膜内HIF-1α、VEGF和ILK的蛋白表达量。2.培养人RPE细胞,采用免疫荧光染色法、免疫细胞化学染色法和western-blot法检测在高糖条件下、有无曲安奈德（TA）作用时,RPE细胞ILK和ICAM-1的表达,实时荧光定量PCR（real time-PCR）检测两者的mRNA表达,免疫组化检测蛋白表达。3.建立氧致视网膜新生血管的小鼠模型,活体内荧光素眼底血管造影显示血管病变,如渗漏、血管迂曲和无灌注区形成;在病理切片计数进入玻璃体腔内血管内皮细胞数量;免疫组化法检测ILK、HIF-1、VEGF在视网膜新生血管中和侵入玻璃体的细胞团内的表达。结果1.免疫组化半定量检测显示,在所有的24个PDR增生膜中,都有ILK的表达,无论是否使用Avastin,其表达量没有显著性差异（P=0.346）。但在Avastin组,PDR新生血管增殖膜中的血管内皮细胞数明显减少,为21.5±3.94个（n=12）,相比之下,未使用Avastin组的细胞数为41.33±7.44个（n=12）,P=0.003,具有统计学显著性差异。PVR视网膜前膜中的细胞数为0。在未使用Avastin的PDR增殖膜中,血管内皮表达HIF-1α和VEGF的量明显高于Avastin组,具有统计学显著性差异（PHIF-1=0.023, PVEGF=0.000）。2.免疫组化、western-blot和免疫荧光染色都显示RPE细胞在高糖培养6 h高表达ILK、ICAM-1蛋白,而实时荧光PCR检测显示在2 h其mRNA表达量开始上调,在6 h下降。高糖对RPE表达ICAM-1的上调作用能被糖皮质激素TA抑制,而ILK的上调不受其抑制。3.在氧致视网膜新生血管小鼠模型,荧光素血管造影显示视网膜血管迂曲增粗,造影剂渗漏,有无灌注区形成。视网膜切片显示模型眼视网膜前的血管内皮细胞数量增加（23.47±8.43比对0.12±0.35, P<0.01）,免疫组化染色显示其高表达HIF-1α、VEGF和ILK。结论1.人PDR增殖膜中的新生血管有ILK表达,提示ILK参与了视网膜新生血管的形成过程;玻璃体内注射Avastin治疗PDR,能够减少视网膜新生血管内皮细胞数量,下调HIF-1α、VEGF在增殖膜的表达,但不能下调ILK的表达。在视网膜新生血管发生中,ILK可能是HIF-1α、VEGF的上游因子。2.RPE细胞在高糖环境下能高表达ILK和ICAM-1,RPE细胞可能通过这两种因子的信号途径而参与DRP的病变。3.在氧致视网膜新生血管小鼠模型中,新生血管的内皮细胞高表达ILK,提示ILK参与了类似的病理改变。创新点1.首次在24例人PDR增生膜中检测到ILK的表达;首次证实抗VEGF疗法（Avastin玻璃体内注射）能明显减少PDR新生血管膜内的血管内皮细胞数量和下调HIF-1α、VEGF的表达,但不能下调ILK的表达。2.首次在氧致视网膜新生血管小鼠模型中检测到ILK的表达,提示ILK参与了视网膜新生血管的发生过程。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 主要的视网膜新生血管性疾病
• 2 整合素连接激酶
• 3 视网膜色素上皮细胞
• 正文
• 实验一 ILK 在PDR 增生膜血管中的表达及Avastin 对其的作用
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 高糖对体外培养人RPE 细胞表达ILK 的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 氧致视网膜新生血管小鼠模型眼内ILK 的表达
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简介
• 待发表文章
• 致谢