论文摘要
研究背景和目的神经干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，是近十几年来移植治疗中枢神经系统疾病的研究热点。不论是内源性再生的神经干细胞，还是外源性移植的神经干细胞，其在损伤周围区域的存活、分化及能否建立有效的功能整合，是影响神经功能恢复的关键因素。本课题组前期研究发现IκBα突变型基因可通过下调永生化神经干细胞中NF-κB的活性，降低部分炎性细胞因子的表达，提高永生化神经干细胞对缺氧缺糖环境的耐受性，但是其对细胞分化及神经功能恢复无显著改善。Cdh1是细胞周期末期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）的调节亚基，在增殖细胞中，它通过泛素化降解特定的底物蛋白起着调控细胞周期的作用。近年来研究发现其在成熟神经元中有大量表达，具有调节神经元轴突生长、突触传递及神经元存活的作用。但是，目前关于APC-Cdh1在神经干细胞增殖分化、神经损伤等中枢神经系统其他方面的作用，尚不清楚。神经干细胞增殖分化与细胞周期密切相关。一方面，神经元即是由神经干细胞出细胞周期分化而成：另一方面，Cdh1在细胞周期的作用主要是维持细胞处于G1期，因此，我们推测Cdh1与神经干细胞分化有关。本研究我们拟通过体内外实验观察Cdh1在中枢神经细胞中的表达分布特点，体外培养大鼠神经干细胞，观察ATRA诱导神经干细胞向神经元分化时Cdh1的表达变化规律；再通过筛选Cdh1 RNA干扰有效靶点，构建Cdh1 RNA干扰慢病毒载体，探讨Cdh1下调对神经干细胞增殖分化的影响，从而进一步认识Cdh1在中枢神经细胞中的作用，为选择Cdh1作为中枢神经系统疾病基因治疗的靶点提供实验依据。研究方法与结果1．APC-Cdh1在中枢神经系统中的表达分布特点方法：取健康成年雄性SD大鼠脑部制作冰冻切片，免疫组化染色检测Cdh1的表达部位，分别用抗神经元核（NeuN）抗体、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光双标检测Cdh1表达的细胞定位情况。取出生24h内乳鼠，原代培养神经元及神经干细胞。免疫组化检测NeuN进行神经元鉴定。Nestin染色进行神经干细胞初步鉴定，加入胎牛血清诱导其分化，免疫组化染色检测GFAP和MAP2的表达鉴定神经干细胞的分化特性。分别提取神经干细胞与成熟神经元总RNA，采用实时定量PCR检测APC两个调节亚基Cdh1与CDC20的表达。结果：大鼠脑组织切片免疫组化DAB染色显示Cdh1在海马、皮层均有大量表达，免疫荧光双标显示Cdh1表达主要定位于神经元中，星形胶质细胞表达较少。原代培养的神经元光镜下可见胞体和较长的细胞突起，NeuN免疫染色为阳性，纯度达90％以上。原代神经干细胞培养至第4～5 d即形成神经球，Nestin染色鉴定为阳性，并能分化为神经元和星形胶质细胞。实时定量PCR检测显示与神经干细胞相比，神经元中Cdh1 mRNA表达升高（1.00±0.05 vs 2.10±0.07，P＜0.05），但CDC20 mRNA几乎没有表达（1.00±0.04 vs 0.02±0.01，P＜0.05）。2．全反式维甲酸诱导原代神经干细胞分化时Cdh1表达的变化方法：取出生24h内乳鼠，原代培养神经干细胞。当培养至第3代时，将神经球接种在预先用0.001％多聚鸟氨酸包被的培养皿中，加入ATRA诱导分化。分为3组：对照组、1μmol／L ATRA组、10μmol／L ATRA组，对照组中仅加入等量的DMSO，其终浓度为0.1％。于诱导开始时、诱导第4天、第8天提取细胞总RNA，采用实时定量PCR检测Cdh1的表达；于诱导第8天，采用免疫细胞化学检测MAP2和GFAP的表达观察神经干细胞向神经元与星形胶质细胞分化情况；采用实时定量PCR检测1μmol／L ATRA诱导神经干细胞分化时Id2 mRNA表达变化。结果：免疫细胞化学检测显示，对照组、1μmol／L ATRA、10μmol／L ATRA诱导组神经干细胞分化为MAP2阳性神经元的比例依次为（19.1±2.8）％、（41.4±0.8）％、（34.3±1.0）％（P＜0.05），其中以1μmol／L ATRA组神经元分化比例最高。与诱导开始时相比，诱导第4天、第8天对照组Cdh1 mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），1μmol／L ATRA组与10μmol／L ATRA组Cdh1 mRNA表达均升高（P＜0.05），且以1μmol／L ATRA组在诱导第8天Cdh1 mRNA表达最高（P＜0.05）。1μmol／L ATRA诱导过程中，诱导第4天、第8天神经干细胞Id2 mRNA表达均较诱导开始时降低（P＜0.05）。3．大鼠Cdh1基因RNA干扰有效靶点的筛选方法：根据大鼠Cdh1基因的编码序列设计3个干扰序列及对照序列，根据pENTR／H1／TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链，退火后连接到pENTR／H1／TO线性载体上，形成完整载体，挑取阳性菌落扩增培养，送生物公司进行测序鉴定。采用脂质体法分别将测序鉴定成功构建的3个干扰载体和对照载体转染大鼠永生化神经前体细胞，同时转染含绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒作为对照，评价基因转染效率。转染后48h提取细胞总RNA，采用实时定量PCR检测Cdh1 mRNA的表达。结果：经1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定重组载体大小正确，约为3kb。经DNA测序鉴定构建的3个干扰载体和对照载体插入的序列均正确，无碱基突变或缺失。细胞转染后24h、48h荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白阳性表达的细胞，即为成功转染的永生化神经前体细胞，转染后24h与48h细胞转染效率分别为（54±5）％、（36±4）％。与转染对照载体相比，转染3个干扰载体细胞Cdh1的表达分别为1.15±0.31、0.37±0.06、0.51±0.08，以第2个干扰载体下调作用最为明显（P＜0.05）。4．大鼠源性Cdh1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定方法：针对已经筛选确定的Cdh1基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-Cdh1 RNAi慢病毒载体，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0（含gag／pol元件）载体、pHelper 2.0（含VSVG元件）载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒，浓缩后分装。采用逐孔稀释滴度测定法将其感染293T细胞，根据GFP蛋白的表达水平计算病毒滴度。分别将LV-Cdh1 RNAi慢病毒及对照慢病毒感染PC12细胞，于感染后72h，提取细胞总RNA和总蛋白，分别采用RT-PCR及western blot检测Cdh1的表达。结果：经PCR和测序证实，成功构建Cdh1基因RNA干扰的慢病毒载体LV-Cdh1RNAi。包装慢病毒，浓缩病毒悬液的滴度为7×108TU／ml。RT-PCR及western blot检测显示感染LV-Cdh1 RNAi慢病毒的PC12细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞Cdh1表达明显降低（P＜0.05）。5．慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰对神经干细胞增殖分化的影响方法：原代培养神经干细胞至第3代，采用含绿色荧光蛋白（GFP）的对照慢病毒，分别以MOI值=1、5、10、20、50和100进行慢病毒感染，感染后72h采用荧光显微镜观察GFP的表达，确定慢病毒感染神经干细胞合适的MOI。再选择MOI=20进行慢病毒感染，分为未感染组、对照慢病毒感染组（LV-control组）、Cdh1 RNA干扰慢病毒感染组（LV-Cdh1 RNAi组）。分别于感染后24h、48h、72h采用MTT法检测Cdh1 RNA干扰慢病毒感染对神经干细胞增殖的影响。于感染后72h，采用2％胎牛血清诱导分化，4d后提取细胞总蛋白，采用western blot检测MAP2和GFAP的表达，观察慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰对神经干细胞分化的影响。结果：慢病毒感染神经干细胞合适的MOI为10～50。MTT检测发现，感染后24h、48h LV-control组与LV-Cdh1 RNAi组吸光度较末感染组增加（P＜0.05），但两组间差异无统计学意义；感染后72h，LV-Cdh1 RNAi组较LV-control组及未感染组吸光度均增加（P＜0.05）。Western blot检测显示LV-Cdh1 RNAi组MAP2表达较LV-control组及未感染组降低（P＜0.05），三组GFAP表达差异无统计学意义（P＞0.05）。6．统计学处理采用SPSS12.0软件进行统计学分析，计量资料采用（?）±s表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用方差分析；计数资料采用率表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。研究结论1．APC-Cdh1在大鼠脑组织中有大量表达，且主要定位于神经元；体外实验表明神经元中Cdh1表达高于神经干细胞。2．ATRA成功诱导神经干细胞向神经元分化，1μM ATRA诱导时，神经元分化比例最高，伴有Cdh1 mRNA表达上调，及其下游底物Id2 mRNA的表达下调。3．采用永生化大鼠神经前体细胞及pENTR／H1／TO中间载体系统，成功筛选出Cdh1RNA干扰的有效作用靶点。4．成功构建大鼠源性Cdh1基因RNA干扰慢病毒载体，包装的慢病毒滴度为7×108TU／ml，在mRNA及蛋白质水平上，均能有效下调Cdh1的表达。5．慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰能促进神经干细胞增殖，抑制其向神经元方向分化。研究总结本课题首先通过体内外实验揭示Cdh1在不同神经细胞中的差异性表达，即Cdh1主要表达在神经元，星形胶质细胞与神经干细胞表达较少。再通过ATRA诱导神经干细胞分化为神经元，发现Cdh1 mRNA的表达随着神经元分化比例的增高而升高，提示Cdh1参与神经干细胞向神经元方向的分化。然后通过筛选Cdh1基因RNA干扰有效靶点，构建Cdh1 RNA干扰慢病毒载体，观察慢病毒介导的Cdh1 RNA干扰对神经干细胞增殖分化的影响，发现Cdh1的表达下调会促进神经干细胞的增殖，抑制其向神经元的分化，进一步明确了Cdh1在神经干细胞分化中的作用。本研究加深了对Cdh1在中枢神经系统作用的认识，表明其在神经细胞发育分化中的可能起着重要作用，为下一步探讨Cdh1在神经损伤后再生修复及基因治疗中的作用奠定了基础。
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