论文摘要
各种创伤如车祸伤、枪弹伤、烧伤及部份内科疾病如糖尿病、肿瘤和瘫痪所致的肢体坏疽都常伴肌组织损伤,对于严重或面积较大的肌损伤或缺损,肌肉的再生相对困难,创面最终被纤维结缔组织替代而形成瘢痕,导致机体运动功能障碍并累及神经、血管系统,影响患者的预后和生活质量。因此,如何促进大面积肌肉缺损后的修复,调控肌细胞分化的过程和其中的调控机制一直是创伤修复研究的热点问题之一。MicroRNA（miRNA）是一类长度为21～23核苷酸（nt）的高度保守的非编码单链小分子RNA,它们一般通过Dicer酶从具有发夹二级结构的前体RNA加工而来,在生长发育、增殖分化、肿瘤发生和病毒感染等多种生物学事件中发挥了重要作用。以往,人们注意力主要集中于传统的与蛋白质合成有关的三种RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的研究,自从小RNA（主要包括miRNA和siRNA两类）被发现之后,已经从人类和线虫体内分别鉴定数百种miRNA,对拟南芥等植物基因组分析结果表明,miRNA大部分都作用于与发育过程相关的转录因子,尤其与表型建立和细胞分化有关。miR-206最初是在从人和小鼠肌肉组织中克隆鉴定出来,长度为22nt,由73nt的茎环结构前体剪切加工成熟,其编码基因定位于6号染色体,与miR-133簇集分布,核心序列与miR-1一致,基因芯片检测提示miR-206在骨骼肌细胞分化成熟过程中表达呈现一定的时空特异性,这提示miR-206可能具有同miR-133和miR-1相关的促成肌分化功能,但其具体的生物学功能还未见详细报道。因此,在本实验中我们首先检测了miR-206在C57小鼠各组织脏器中的表达情况;然后利用C2C12细胞模拟体外成肌分化过程,观测miR-206在成肌分化过程中的表达变化;克隆构建miR-206的腺病毒表达载体和合成化学修饰反义链,转染C2C12细胞和骨髓间充质干细胞,使其在细胞中过表达或者抑制其表达的情况下,观察对细胞成肌分化的影响,明确其生物学功能。主要的结果如下:1. miR-206在C57小鼠的骨骼肌和心肌中呈强阳性表达,小肠、脾脏、肺脏组织有少量表达,脑、肾脏、肝脏组织未见阳性表达,表明miR-206的分布具有组织特异性。2.利用C2C12细胞在体外成功诱导其向成肌细胞分化,通过形态学观察,RT-PCR、western-blot、细胞免疫荧光组织化学及流式细胞仪等方法进行检测,证实我们所建立的细胞分化模型是成功的,并观察到随着诱导时间的延长,miR-206在成肌分化过程中表达量逐渐增高的,表达改变具有阶段特异性。3.成功克隆了miR-206基因并构建到腺病毒表达载体中。利用PCR技术扩增出mi-206基因片段,通过T-A克隆连接至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,然后转化含骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组产生腺病毒载体质粒pAdEasy/miR-206,转染293细胞后包装出重组病毒载体Adv/mir-206病毒。提取转染后的293细胞基因组DNA进行PCR反应,可成功扩增出354bp的目的片段,Northern-blot显示转染后293细胞miR-206呈阳性表达。4. miR-206的生物学功能的初步观察:将Adv/miR-206转染C2C12细胞,使其高表达miR-206,在未加入诱导剂的情况下,可见C2C12细胞向成肌细胞分化,有粗大多核的肌管形成,肌特异性相关蛋白MHC表达增加,而Adv/GFP空质粒转染组则没有此类变化,说明在无诱导剂的情况下,提高miR-206在C2C12细胞的表达水平也可以促进细胞向成肌方向分化。利用反义核酸技术将miR-206反义链导入C2C12细胞后,再加入诱导剂进行诱导分化,其结果显示导入反义链的C2C12细胞在加入诱导剂的情况下,向成肌分化的能力明显减弱,诱导分化第2天计数胞体比C2C12细胞伸长2倍以上的细胞数比率,可见反义链转染组为35%,而正常细胞诱导组为87%,说明在有诱导剂的情况下,阻断了miR-206在C2C12细胞的表达可明显降低C2C12向成肌方向分化的能力。因此,我们认为miR-206是参与成肌分化并且维持这种分化状态的一个关键性调节因子。5.对Adv/miR-206转染后的C2C12细胞进行流式细胞仪检测,发现Adv/mi206转染能够促使C2C12的S期细胞比例明显下降,退出细胞分裂周期,以利于其进入分化状态,而Adv/GFP空载体转染组C2C12细胞周期改变不明显;Adv/miR-206转染至MSC可见细胞形态伸长,双核细胞比例明显增加。由此,推测提高miR-206的表达可能模拟了发育过程中的某些信号,通过作用于细胞周期蛋白等因子,促使细胞退出分裂周期,进入分化状态,从而发挥促进成肌分化的作用。