ω-3脂肪酸去饱和酶基因的克隆、鉴定及转基因小鼠的制备

论文摘要

多不饱和脂肪酸（PUFAs）是一类被广泛研究和关注的脂肪酸。PUFAs主要包括ω-6和ω-3 PUFAs两种类型,每一种类型都包括多个从短碳链（18 C）到长碳链（22 C）的、且含有多个不饱和键的脂肪酸。越来越多的研究证明,PUFAs具有广泛的生物学功能,它们参与细胞膜的构成并作为许多细胞应答过程中的信号分子,与人类的多种疾病的发生紧密相关,其适宜的含量对于人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要。从总体上来说,ω-6 PUFAs对人体意义不大,其过量的摄入反而会危害人体健康。而ω-3 PUFAs对人体却具有积极的意义,已被证实在预防和治疗心血管疾病、关节炎、癌症等多种疾病方面发挥着重要作用。由于哺乳动物及人类都不能在体内合成ω-3 PUFAs与ω-6PUFAs,因此必须从食物中摄取。但自然界中ω-6 PUFAs含量丰富而ω-3 PUFAs含量极少,导致人体中ω-6 PUFAs摄入过多而ω-3 PUFAs摄入严重不足,使人体中ω-6/ω-3之比高达16以上。因此,如何使人体增加ω-3 PUFAs的摄入量就成了合理利用脂肪酸的关键,也是当今世界人们所关心的一个问题。基因工程技术与转基因动物技术的快速发展,为体外生产更多的ω-3 PUFAs提供了新的契机,也逐渐成为科学家们努力的方向之一。ω-3脂肪酸去饱和酶基因是ω-3 PUFAs合成的关键基因,它们利用ω-6 PUFAs为底物,在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成一个不饱和键（烯键）,从而合成相应的ω-3 PUFAs。近年来,各国科学家克隆了多个ω-3脂肪酸去饱和酶基因,但其中大部分基因只能合成18 C的ω-3 PUFAs,开发利用价值不大。虽然也有报道能够合成更长链的ω-3 PUFAs基因,如真菌Saprolegnia diclina的ω-3脂肪酸去饱和酶能够合成20 C的ω-3 PUFAs,另一种真菌Mortierella alpina 1S-4不但能合成20 C的ω-3 PUFAs,而且能合成18 C的ω-3 PUFAs,但迄今尚未见这些基因用于基因工程或转基因动物中生产ω-3 PUFAs的报道。真正用于此类研究的基因是来自线虫C.elegans的ω-3脂肪酸去饱和酶基因fat-1。该基因转入哺乳动物细胞及小鼠后能使从18 C到22 C的ω-3 PUFAs的含量增加,显示出很大的开发利用价值。但美中不足的是,所合成的ω-3 PUFAs中价值更大的22 C的ω-3 PUFA（s如docosapentaenoic acid,DPA和docosahexaenoic acid,DHA）水平仍然很低。因此,能否找到在转基因动物体内广泛表达各种ω-3 PUFAs,且其DPA和DHA的水平更高的类似fat-1基因,则成为该问题的关键。本研究通过GenBank检索和文献调研,发现线虫C.Briggsae具有类似fat-1基因的基因组序列（为C.Briggsae基因组的测序结果,GenBank登录号为CAAC01000009）,其氨基酸编码较C.elegans少了两个氨基酸。二者的核苷酸序列同源性为71.5%,氨基酸同源性为86.1%,未见其进一步的研究报道。本研究建立了一种新的基因合成方法,即用PCR法结合酶切连接法拼接化学合成的寡聚核苷酸来合成线虫C.Briggsae具有类似fat-1基因的全序列,并把合成的该基因命名为sFat-1。整个过程仅用了3轮PCR（共7个反应）、2轮酶切连接（3个反应）,便完成了1226 bp的sFat-1基因的克隆。基因克隆前经过密码子优化设计,以便更适合在哺乳动物中表达。将构建的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP通过脂质体转染CHO细胞系并对其进行抗性筛选,获得了稳定转染的细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的气相色谱-质谱联用（GC-MS）的分析表明,sFat-1基因完全能在CHO细胞中表达并发挥其ω-3去饱和酶的作用,即催化ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%（转染GFP的CHO细胞）下降到35.29%（转染sFat-1的CHO细胞）,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明线虫C.Briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的克隆是成功的。更重要的是,与已有的研究结果相比,sFat-1基因转移到哺乳动物细胞CHO中可以产生更高含量的DPA（5.98%）和DHA（1.97%）,初步证明该基因可能更有利于更长链的ω-3系列不饱和脂肪酸的合成。将载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP作为转基因动物表达载体,通过显微注射法制备转基因小鼠,在出生的33只后代小鼠中,经PCR和Southern blot鉴定,最终获得5只转基因小鼠。经对后代小鼠的检测,证明其多种组织及乳汁中合成了LA（linolenic acid , 18:3n-3）、EPA（eicosapentaenoic acid, 20:5n-3）、DPA（docosapentaenoic acid, 22:5n-3）、DHA （docosahexaenoic acid, 22:6n-3）等各种ω-3 PUFAs。所检出的ω-3 PUFAs的种类与CHO细胞转染的情况类似,但转基因小鼠各种组织都表达和产生了极为丰富的更长链的DHA和DPA。在肌肉组织中DHA平均含量高达12.15%,ω-3 PUFAs总含量平均高达23.04%。这些数据远远超出了C.elegans的ω-3去饱和酶基因fat-1在一系列转基因试验的结果。这再次表明本研究所合成的sFat-1基因能够在转基因动物中产生更多、更长链的、且更有价值的DHA以及DPA。此外,本研究还构建了乳腺特异性表达载体pBC1-sFat1,并通过同样的显微注射法获得了5只转基因小鼠（共生了24只小鼠）,对后代检测发现,其中1只转基因小鼠的乳汁中表达了ω-3 PUFAs产物,且略高于周身性表达的转基因小鼠乳腺中所合成的各种ω-3 PUFAs。这为sFat-1在牛、羊等家畜上利用乳腺特异性表达载体表达ω-3 PUFAs奠定了实验基础。最后,本研究还尝试了利用慢病毒载体法生产转基因小鼠的可行性。以sFat-1为目的基因构建了慢病毒表达载体及其完整表达系统,通过转染293FT细胞生产慢病毒颗粒,病毒滴度约为5.0×106 TU/mL,经感染NIH3T3细胞系,表明该慢病毒对哺乳动物细胞具有良好的感染能力。再用该慢病毒感染小鼠早期胚胎,结果表明,所获得的慢病毒颗粒完全可以侵染小鼠胚胎。该研究初步证实利用慢病毒载体法制备转基因动物是完全可行的,为sFat-1走向实际应用提供了科学依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 多不饱和脂肪酸的功能及其基因工程研究进展
• 1.1 Ω-3 和Ω-6 多不饱和脂肪酸的生理功能
• 1.2 Ω－3PUFAS 在药用价值方面的研究进展
• 1.3 多不饱和脂肪酸与大脑的发育和功能维持
• 1.4 Ω-6 和Ω-3PUFAS 的生物合成
• 1.5 PUFAS 的基因工程合成的研究进展
• 1.6 前景与展望
• 第二章 应用慢病毒载体法制备转基因动物的研究进展
• 2.1 慢病毒及慢病毒转基因载体系统
• 2.2 慢病毒载体法用于动物转基因的实践
• 2.3 存在的问题和改进对策
• 第三章 SFAT-1 基因的人工合成
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 sFat-1 基因的人工合成设计
• 3.1.3 寡核苷酸片段的合成
• 3.1.4 寡核苷酸片段的PCR 法拼接与酶切连接
• 3.1.5 全长基因的克隆及序列分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 密码子优化及二级结构预测
• 3.2.2 sFat-1 基因的人工合成和PCR 拼接
• 3.2.3 合成sFat-1 基因克隆及验证
• 3.3 讨论
• 第四章 SFAT-1 基因在哺乳动物细胞系的表达和功能研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 哺乳动物细胞系表达载体的构建
• 4.1.3 细胞培养与传代及冻存
• 4.1.4 阳离子脂质体法转染CHO 细胞
• 4.1.5 RT-PCR 初步鉴定
• 4.1.6 脂肪酸的分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 带有表达EGFP 的表达质粒pcDAN3.1-sFat-1-EGFP 的构建
• 4.2.2 pcDAN3.1-sFat1-EGFP 在CHO 细胞系的表达
• 4.2.3 sFat1 基因的表达及其对CHO 细胞脂肪酸组成的影响
• 4.3 讨论
• 第五章 显微注射法制备转基因小鼠
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 质粒构建
• 5.1.3 显微注射
• 5.1.4 小鼠基因组DNA 的制备
• 5.1.5 转基因小鼠的PCR 鉴定
• 5.1.6 转基因小鼠的Soutrern blot 鉴定
• 5.1.7 首建者转基因小鼠的传代
• 5.1.8 RT-PCR 检测转基因小鼠在不同组织器官的表达情况
• 5.1.9 转基因小鼠中sFat-1 基因表达即脂肪酸组成变化的鉴定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 质粒pBC1-sFat1 的构建
• 5.2.2 显微注射
• 5.2.3 转基因小鼠的PCR 检测
• 5.2.4 转基因小鼠的Southern blot 鉴定
• 5.2.5 首建者转基因小鼠的传代
• 5.2.6 RT-PCR 检测转基因小鼠在不同组织器官的表达情况
• 5.2.7 转基因小鼠中sFat-1 基因表达即脂肪酸组成变化的鉴定
• 5.3 讨论
• 5.3.1 关于转基因动物的制作
• 5.3.2 关于sFat-1 基因的周身性表达和乳腺特异性表达
• 第六章 制备SFAT-1 转基因动物的慢病毒载体的构建及病毒生产
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 病毒表达质粒的构建
• 6.1.3 动物转基因慢病毒的生产
• 6.1.4 转染NIH3T3 细胞鉴定病毒感染力
• 6.1.5 感染小鼠胚胎
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 慢病毒表达质粒7ZF-PLV-EGFP 的构建
• 6.2.2 慢病毒表达质粒7ZF-PLV-sFat1 的构建
• 6.2.3 以293FT 细胞系生产慢病毒颗粒
• 6.2.4 感染NIH3T3 细胞鉴定病毒感染力
• 6.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介