论文摘要
目前,畜牧业中由于抗生素的滥用造成的诸多问题,如细菌耐药性的增加及畜产品抗生素残留正且益成为危害人类健康的重大问题。因此寻找安全、环保、高效的抗生素替代品成为当前畜牧业生产中研究的热点。抗菌肽广泛存在于生物体内,具有抗菌谱广、抗菌效率高、不易产生耐药性等优点,有望成为理想的抗生素替代品。抗菌肽是鱼类先天性免疫（非特异性免疫）的重要组成部分,在鱼类受伤或受到微生物感染时能以最快速度产生并对抗感染性疾病,对机体起到一定的保护作用。其中ParasinⅠ是一种从受伤鲶鱼体表粘液中被分离的广谱抗菌肽,对G-、G+、真菌均表现出较高效抑制或杀灭作用,且无溶血活性,具有较高的研究和开发应用价值。但天然ParasinⅠ需要经表皮受伤诱导才能表达,直接分离纯化较为困难,这限制了其开发利用。本研究的目的是通过基因工程技术,构建抗菌肽ParasinⅠ的高效表达载体,利用大肠杆菌表达系统成功实现抗菌肽ParasinⅠ基因工程重组表达,从而为其进一步应用研究奠定基础。根据鲶鱼ParasinⅠ的肽序列和大肠杆菌密码子偏好,设计、优化并合成长度为57bp的ParasinⅠ基因序列,以此基因为模板,设计上游引物时引入承载分子Xa因子（Activated Factor Xa）,通过PCR扩增得到的基因连接到克隆载体pMD18-T,序列分析结果表明扩增基因序列与设计的基因序列完全一致。KpnⅠ和HindⅢ双酶切pMD18-T-ParaⅠ并回收目的基因,与经同样酶切的大肠杆菌高效表达载体pET32-a（+）连接,构建表达载体pET32-a（+）-ParaⅠ,通过电击将重组表达转入大肠杆菌（?）Rosetta（DE3）,抗生素（Amp）筛选获得阳性转化子Rosetta（DE3）/pET32-a（+）-ParaⅠ.用IPTG对阳性转化子进行37℃和20℃诱导表达,超声波破碎处理大肠杆菌菌体,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测,结果表明两种温度诱导的融合蛋白分子量均为21kDa,其中37℃诱导产生的蛋白全为包涵体蛋白,20℃诱导产生的融合蛋白全为可溶性蛋白,成功实现了鲶鱼抗菌肽ParasinⅠ在大肠杆菌中的表达。凝胶蛋白分析软件（Quantity one 4.6.2）分析表明37℃诱导和20℃诱导表达的融合蛋白含量分别占菌体总蛋白的49.7%和48.9%。包涵体蛋白经8M尿素变性后再进行透析复性,蛋白全部析出,无法进行后序实验研究；可溶性融合蛋白N-末端含有6×His Tag,用NiSepharose TM亲和层析柱进行纯化,考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度为0.179mg/mL将纯化的融合蛋白用Xa因子酶切,去掉融合标签部分还原抗菌肽ParasinⅠ,以Amp为对照,琼脂孔扩散法检测其对对数生长期的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制作用。结果显示：Amp在5pg时即可表现出很强的抑菌作用,还原的抗菌肽ParasinⅠ在36μg能够抑制金黄色葡萄球菌的生长,融合蛋白则无抑菌作用。综上所述,本研究构建了重组鲶鱼抗菌肽ParasinⅠ的表达载体,实现了其大肠杆菌中的表达,并对活性进行了初步的分析,为ParasinⅠ的应用研究奠定基础。