论文摘要
目的:优选提取、分离、纯化冬凌草多糖的方法,探究部分分离纯化组分的物理化学性质、多糖含量及单糖组成,并对其免疫活性进行初步研究。方法:1、以冬凌草粗多糖干重得率为指标考察了水浸提取法、纤维素酶酶解法、果胶酶酶解法、复合酶酶解法对冬凌草多糖提取产率的影响,筛选适宜提取方法。以冬凌草多糖损失率和蛋白质去除率为指标考察三氯乙酸-正丁醇法、三氯乙酸-Sevage法、Sevage法、三氯乙酸法对冬凌草粗多糖脱蛋白作用的影响,优选适宜工艺。同时,以冬凌草多糖损失率和糖液透光性为指标比较不同浓度过氧化氢、活性炭对冬凌草粗多糖脱色效果的影响。选用DEAE-Sepharose FastFlow（Cl-型）弱极性阴离子交换层析法、乙醇分级醇析法分别对冬凌草粗多糖进行分离纯化。2、通过观察分离纯化所得各组分冬凌草多糖与α-萘酚（Molish反应）、蒽酮、苯酚、Fehling试剂、碘化钾-碘试剂作用现象判断多糖的理化性质,对多糖进行定性鉴定。比较苯酚-浓硫酸法、蒽酮-浓硫酸法优选冬凌草多糖含量测定的适宜方法并考察反应时间、反应温度、对照品选择对蒽酮-浓硫酸法测定冬凌草多糖含量的影响,选取最佳反应条件。硫酸钡比浊法测定冬凌草多糖不同分离组分中硫酸基含量。通过紫外分光光度法、纸层析法、凝胶柱层析法对冬凌草多糖分离组分RRPS-Ⅱ-Ⅰ进行纯度分析,选用TLC法、HPLC法分别检测所得冬凌草精致多糖RRPS及分离组分RRPS-Ⅱ-Ⅰ的单糖组成。采用红外光谱、β-消除反应进一步对冬凌草分离得的各组分多糖进行化学结构研究。自动旋光仪测定RRPS-Ⅱ-Ⅰ的旋光度。3、通过噻唑兰比色法（MTT）观察冬凌草多糖在体外对小鼠脾淋巴细胞增殖的直接促进作用,及对有丝分裂原刀豆蛋白ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的协同作用,以初步证明其免疫活性。结果:1、选取料液比1:15,重蒸水热回流提取2次,调乙醇浓度约为80%进行醇沉;优选10%三氯乙酸2次脱蛋白,1.5%活性炭脱色除杂;DEAE-SepharoseFast Flow（Cl-型）弱极性阴离子交换层析法、乙醇分级醇析法分别对冬凌草粗多糖进行分离纯化。DEAE-Sepharose Fast Flow（Cl-型）弱极性阴离子交换层析法分离得到5个组分,主要组分为RRPS-B,RRPS-D。通过分级醇析初步得到4个冬凌草多糖组分,分别命名为RRPS-ⅠRRPS-ⅡRRPS-ⅢRRPS-Ⅳ。2、蒽酮-硫酸显色法测定稳定性好,0.2%蒽酮-浓硫酸溶液,100℃水浴加热15 min,于冰浴中冷却40 min,RSD为0.8%。冬凌草多糖均一组分RRPS-Ⅱ-Ⅰ为淡褐色粉末,初步认为为一种蛋白糖,极易溶于水,其多糖含量为89.1%,蛋白质含量为7.8%,比旋度为—412.16°,由N-型糖肽键连接而成。红外光谱表明,RRPS-Ⅱ-Ⅰ的单糖构型为α-吡喃型苷键。HPLC-ELSD测定其单糖组成为鼠李糖、葡萄糖。3、从冬凌草中提取的多糖具有增强免疫的生物活性。5～100μg/ml浓度范围内,RRPS-Ⅱ,RRPS-Ⅱ-Ⅰ均能有效的刺激小鼠脾淋巴细胞增殖。100μg/ml RRPS-Ⅱ,5μg/ml,50μg/ml RRPS-Ⅱ-Ⅰ均能有效增强ConA诱导的淋巴细胞增殖反应,表现出不规则剂量依赖性趋势。结论:通过研究冬凌草多糖的提取、分离和纯化方法,确定了经济、高效、实用的提取分离精致工艺,建立了简便、准确冬凌草多糖含量测定的方法,且冬凌草中提取的多糖各组分具有增强免疫的生物活性,其进一步的免疫调节作用及其机理与化学结构的关系还有待继续深入研究。