北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性评价及GFP基因在病理学研究中的应用

论文摘要

本研究利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析了北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性和遗传分化,建立了根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化体系,将外源gfp基因导入玉米丝轴黑粉菌并成功表达。获得的主要结果如下:1.筛选出26个扩增稳定、带纹清晰的RAPD引物,对从玉米丝黑穗病发生严重的大部分北方省市收集分离的68个玉米丝轴黑粉菌菌株进行了DNA遗传多样性分析,结果表明,RAPD谱带多态性为98.33%,北方玉米丝轴黑粉菌具有丰富的遗传多样性,遗传分化明显;种群内遗传变异小于种群间遗传变异。玉米丝轴黑粉菌遗传分化除明显受地理阻隔影响外,也可能与玉米种子调运过程中携带病菌基因的遗传迁移相关。2.利用NTSYS软件进行系统聚类分析表明,相似系数为0.76阀值时,68个菌株可划分为13个类群。研究结果完善和丰富了我国玉米丝轴黑粉菌遗传多样性评价研究,对玉米抗病资源筛选和抗病育种具有重要参考价值。3.构建带有报告基因gfp的重组双元质粒载体pCAMBIA0611,利用热击法导入根癌农杆菌,并成功实现了对玉米丝轴黑粉菌的转化。4.对不同的根癌农杆菌菌株、不同的玉米丝轴黑粉菌担孢子成熟度、不同的根癌农杆菌浓度等转化条件的比较研究,建立了根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化体系,结果表明根癌农杆菌GV3101介导,玉米丝轴黑粉菌担孢子在CM中培养3d,根癌农杆菌菌液OD600值为0.4左右时,转化效率最高,能达到280个转化子/106个细胞。5.将转化菌株与野生型菌株混合于PD液体中摇床培养,显微镜检发现两者能彼此结合,产生双核菌丝。说明外源基因的插入没有导致与交配结合相关的基因发生突变。6.利用注射法将结合的双核菌液接种于玉米自交系黄早四,二叶一心期PCR检测叶片表明转化菌株侵入到玉米叶片中,说明转化菌株对玉米具有一定的侵染力。成熟期田间能观察到发病植株,并有玉米丝轴黑粉菌冬孢子产生,表明转化菌株具有一定的致病性,侵染植株后能导致发病。7.田间发病植株雄穗小穗切片观察,能观察到玉米组织细胞间隙有明显的菌丝存在。荧光共聚焦显微镜观察,发现菌丝在玉米植株体内能产生绿色荧光。从而为跟踪菌丝的繁殖、扩展,研究抗病机理提供了新的研究手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 部分缩略语表
• 前言
• 1 玉米丝黑穗病的研究进展
• 1.1 玉米丝黑穗病的分布与危害
• 1.1.1 玉米丝黑穗病在我国的分布
• 1.1.2 玉米丝黑穗病的危害
• 1.2 玉米丝黑穗病病原菌的生理小种分化
• 1.3 玉米丝黑穗病的症状与鉴定方法
• 1.3.1 症状
• 1.3.2 鉴定方法
• 1.4 玉米丝黑穗病病原菌的侵染机制研究
• 2 随机扩增多态性DNA（RAPD）研究进展
• 2.1 RAPD技术简介
• 2.2 RAPD技术在真菌研究中的应用
• 3 真菌的遗传转化研究进展
• 3.1 根癌农杆菌介导的真菌的遗传转化
• 3.1.1 根癌农杆菌介导转化真菌的分子生物学原理
• 3.1.2 影响转化的因素
• 3.1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化在真菌中的应用
• 3.2 真菌的原生质体转化
• 3.2.1 影响原生质体转化的因素
• 3.2.2 原生质体转化在真菌中的应用
• 4 绿色荧光蛋白（GFP）作为生物标记在病原真菌中的应用
• 5 本课题研究的目的和意义
• 第一章 北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 玉米丝轴黑粉菌的分离
• 1.2.2 DNA的提取及纯化
• 1.2.3 DNA的检测
• 1.2.4 PCR反应
• 1.2.5 电泳检测和数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 玉米丝轴黑粉菌的特异引物检测
• 2.2 丝轴黑粉菌的遗传多态性分析
• 2.3 种群间遗传距离和遗传相似性
• 2.4 种群间遗传分化
• 2.5 基因流的影响
• 2.6 种群和个体间遗传聚类关系
• 2.7 主坐标分析
• 3 讨论
• 第二章 根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒载体
• 1.1.2 菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 含重组质粒的农杆菌的制备与培养
• 1.2.1.1 高效启动子gpd的扩增
• 1.2.1.2 含高效启动子trpC，gpd的双元载体的构建
• 1.2.1.3 质粒的大肠杆菌转化
• 1.2.1.4 质粒的提取和鉴定
• 1.2.1.5 质粒的根癌农杆菌转化
• 1.2.1.6 农杆菌质粒酶切鉴定
• 1.2.2 根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化
• 1.2.2.1 潮霉素抑制玉米丝轴黑粉菌生长的最低浓度的筛选
• 1.2.2.2 根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的转化
• 1.2.2.3 转化子的PCR鉴定
• 1.2.2.4 用于转化的根癌农杆菌最佳菌株的筛选
• 1.2.2.5 用于转化的丝轴黑粉菌担孢子最佳成熟度的筛选
• 1.2.2.6 用于转化的根癌农杆菌最佳浓度的筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 扩增GPD启动子序列测序结果分析
• 2.2 含trpC启动子载体的构建及鉴定
• 2.3 潮霉素抑制玉米丝轴黑粉菌生长的最低浓度的筛选
• 2.4 转化子的潮霉素筛选
• 2.5 转化子的PCR鉴定
• 2.6 用于转化的根癌农杆菌最佳菌株的筛选
• 2.7 用于转化的丝轴黑粉菌担孢子最佳成熟度的筛选
• 2.8 用于转化的根癌农杆菌最佳浓度的筛选
• 3 讨论
• 第三章 转化GFP菌株侵染玉米
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物材料的准备
• 1.2.2 转化菌株配对
• 1.2.3 二眯基-2-苯基吲哚（DAPI）染色观察
• 1.2.4 幼苗期接种
• 1.2.5 苗期PCR检测
• 1.2.6 成熟期冬孢子检测
• 1.2.7 切片制备
• 1.2.8 普通显微镜镜检
• 1.2.9 荧光共聚焦显微镜（LSCM）观察
• 2 结果与分析
• 2.1 DAPI染色观察
• 2.2 幼苗期PCR检测
• 2.3 玉米成熟期田间取样观察结果
• 2.4 切片普通显微镜镜检结果
• 2.5 切片荧光共聚焦显微镜镜检
• 3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录1 试剂和培养基制备
• 附录2 大肠杆菌电转化感受态的制备
• 附录3 质粒的大肠杆菌转化
• 附录4 根癌农杆菌感受态的制备
• 附录5 质粒的根癌农杆菌转化
• 附录6 凝胶回收DNA片段（TaKaRa）
• 附录7 碱裂解法提取质粒（小样法）
• 附录8 大样法抽提高浓度质粒
• 附录9 用苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）进行DNA样品的纯化
• 附录10 PCR产物的纯化
• 附录11 克隆gpd序列比对结果