RNA干扰人食管平滑肌细胞GIRK4基因表达的实验研究

论文摘要

研究一人食管平滑肌细胞中GIRK表达的实验研究目的:探讨食管下段平滑肌中有无GIRK的表达以及各亚型之间表达的差异性,同时明确食管环形平滑肌（CM）与纵行平滑肌（LM）之间表达的区别,从食管自节律入手深入研究食管运动功能的深层机制,为进一步研究食管功能的调节打下基础。方法:根据24h食管pH值检测、食管镜检查及HE染色结果,分辨、筛选正常人食管平滑肌,按人GIRK 1-4序列设计并合成各自的高效引物,利用RT-PCR、Western Blotting方法检测人食管平滑肌细胞中GIRK 1-4的表达。结果:RT-PCR及Western Blotting检测证明人食管平滑肌细胞仅表达GIRK 1-4中的GIRK2、3、4;其中GIRK4表达最为丰富;但GIRK2与GIRK3的表达无明显差异性（P>0.05）;而GIRK2与GIRK4,GIRK3与GIRK4的表达却差异均显著（ P<0.05）; LM和CM组的表达亦无明显差异（P>0.05）。结论:人食管平滑肌细胞不表达GIRK1,仅表达GIRK 2、3、4;其中GIRK4的表达最丰富;GIRK2、GIRK3的表达相对较少;人食管LM和CM GIRK 2、3、4的表达无显著差异性。研究二筛选高效人GIRK4基因RNA干扰序列、构建重组腺病毒载体实验一:RNA干扰质粒的构建目的:构建编码人GIRK4的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术从转录后水平进行GIRK4的研究做准备。方法:根据人GIRK4序列设计并合成四组shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGCsi-U6,采用PCR进行鉴定,并使用377型测序仪进行测序分析。结果:PCR证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与与设计的相同,获得了人GIRK4的shRNA表达载体质粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）。结论:构建GIRK4的shRNA真核表达载体可进入哺乳动物细胞内表达短发夹RNA,通过Dicer酶裂解成siRNA并降解靶基因mRNA,而达到RNA干扰的作用,为利用其进行GIRK4功能研究奠定基础。实验二:GIRK4基因融合蛋白表达载体的构建目的:构建编码人GIRK4真核表达载体质粒,为进行人GIRK4的shRNA序列的筛选作准备。方法:以购买的人GIRK4基因为模板,PCR其cDNA编码序列克隆进入载体pEGFP-C1,进行PCR鉴定、测序及转染293细胞在荧光显微镜下观察。结果:PCR证明cDNA已插入载体,经测序显示与与设计的序列相同,获得人GIRK4融合蛋白的表达载体质粒（pEGFP-GIRK4-C1）,并能转染293细胞表达融合蛋白。结论:构建的人GIRK4真核表达载体可进入哺乳细胞内表达GIRK4-EGFP融合蛋白,为进行针对GIRK4基因RNA干扰序列筛选打下基础。实验三:RNA干扰有效靶点的筛选目的:确定外源表达系统中（HEK293 cell）GIRK4-shRNA沉默GIRK4基因表达的有效性及选择高效的干扰序列。方法:将已构建的四个靶向GIRK4基因不同区域GIRK4的shRNA表达载体质粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）、对照质粒分别与人GIRK4的真核表达载体质粒（pEGFP-GIRK4-C1）共转染HEK293细胞,收集转染48h后的细胞,进行Western blotting检测。结果:转染48小时后与对照组相比,四个不同序列的shRNA表达载体质粒（pGCsi-GIRK4-shRNA-U6）使GIRK4表达在48小时分别减少78.1%、85.3%、88.3%、94.3%,其中以4#载体GGCTGAGCAGAATGAAGAA呈最有效的干扰序列。结论:成功地在外源表达系统筛选出了针对人GIRK4基因的高效RNA干扰序列GGCTGAGCAGAATGAAGAA。实验四:腺病毒表达载体构建目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建重组腺病毒载体Ad-GIRK4-shRNA并在293细胞中扩增制备重组腺病毒载体。方法:将合成的针对GIRK4的4#高效干扰序列,克隆到pDC316-EGFP-U6载体中,再将pDC316-GIRK4-shRNA-EGFP-U6载体和骨架病毒pBHGloxE1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并行PCR鉴定和测序。结果:经PCR鉴定和测序,证实构建的4#干扰序列重组腺病毒载体（Ad-GIRK4-shRNA）正确并制备出高滴度重组病毒。结论:成功构建了携带人GIRK4 shRNA片段的高效重组腺病毒载体（Ad-GIRK4-shRNA）,为深入研究人食管平滑肌GIRK4基因奠定了基础。研究三RNA干扰人食管平滑肌细胞GIRK4基因的实验研究实验一:人食管平滑肌细胞的培养目的:培养出一定数量状态良好的人食管平滑肌细胞备实验二用。方法:联合运用Ⅰ型胶原酶和ⅩⅣ型蛋白酶消化人下段食管标本,利用差速贴壁法消除大部分非食管平滑肌细胞,采用α-actin染色,Elivision二步法进行免疫组化鉴定。结果:经actin抗体鉴定,培养出的细胞90%以上均为食管平滑肌细胞。结论:成功培养出人食管平滑肌细胞,可供进一步行RNA干扰人食管平滑肌细胞GIRK4基因实验所用。实验二:RNA干扰人食管平滑肌细胞GIRK4基因的实验研究目的:探讨GIRK4 shRNA导入人食管平滑肌细胞进行RNA干扰GIRK4表达的可行性,观察对迷走神经通路上的M2AChR表达及IKACh电流密度的影响。方法:用重组腺病毒载体Ad-GIRK4-shRNA转染人食管平滑肌细胞,于转染后不同时间收集细胞,利用RT-PCR、蛋白印迹来检测GIRK4、M2AChR的表达,全细胞膜片钳技术检测IKACh、IK1电流密度的变化。结果:Ad-GIRK4-shRNA在MOI 20对人食管平滑肌细胞转染效率达到95%以上,呈现剂量依赖性和时间依赖性: MOI 5 , 20 , 50时,Ad-GIRK4-shRNA干扰效率分别为15.1%, 35.2%, 51.1%（P<0.05）;与空病毒感染组比较,人食管平滑肌细胞感染Ad-GIRK4-shRNA后GIRK4 mRNA表达在24th、48 th、96 th分别为50.9%、14.7%、98.1%;Ads-GIRK4-shRNA在mRNA和蛋白水平使M2AChR的表达增加了19.6%,18.6%（P<0.05）。Ad-GIRK4-shRNA对IK1的电流密度无影响（P>0.05）,使IKACh的电流密度下降了53%（P<0.05）。结论:Ad-GIRK4-shRNA可高效、成功转染人食管平滑肌细胞,其可能在mRNA和蛋白水平降低了GIRK4的表达,呈现剂量依赖和时间依赖性关系;提示人食管平滑肌细胞行RNA干扰GIRK4的表达是可能的;GIRK4的表达下降进而导致M2AChR表达的增高,IKACh的电流密度下降;表明GIRK4在食管M2受体-G蛋白-IKACh通路和IKACh通道中起重要作用,干扰GIRK4的表达具有潜在的治疗效应;为将RNA干扰技术引入食管运动功能障碍机制的研究、基因治疗提供了新思路。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 研究一 人食管平滑肌细胞中GIRK 表达的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 研究二 筛选高效人GIRK4 基因RNA 干扰序列及构建鉴定重组腺病毒载体
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 研究三 RNA 干扰人食管平滑肌细胞GIRK4 基因表达的实验研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢