大豆疫霉菌的EMS化学诱变

论文摘要

由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引致的大豆疫霉根腐病是大豆毁灭性病害之一,是我国重要的检疫性病害。由于大豆疫霉菌的经济重要性,对其遗传变异、生理分化、基因组学以及全基因组测序等相关研究已经开展很多,使其逐渐成为卵菌遗传学和生物学研究的一个模式种。大豆疫霉菌的全基因组测序已在2004年完成,这使得利用基因组定向诱变检测技术（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes,TILLING）通过鉴定目标基因的突变类型,从而开展反向遗传学研究成为可能。以甲基磺酸乙酯（Ethylmethane Sulfonate,EMS）为诱变剂,通过其对大豆疫霉菌休止孢萌发的影响,确定化学诱变条件。通过收集单卵孢子,建立了包含640个单卵孢子系的突变体库。在菌株培养过程中发现约有50%的诱变菌系在培养性状和菌落形态方面发生了明显变化。菌落形态多样,表现出较紧密或松散,近圆形或不规则;气生菌丝减少,生长速度较慢或快;在卵孢子产量方面亦表现明显的变异,8.13%的菌系有增加,20.41%的菌系减少,27.82%的菌系极少或者没有卵孢子产生,43.64%的菌系卵孢子产量类似野生型。这些结果表明EMS诱变产生的突变体含有许多变异。为检测突变体库的质量,以质膜氢离子泵蛋白基因PsPMA1（Plasma Membrane H+-ATPase 1）为对象,利用TILLING技术,从320个大豆疫霉菌突变体中获得9个突变体,进一步确认了EMS对大豆疫霉菌的诱变效果,并且估算EMS对大豆疫霉菌的诱变频率至多每115kb发生一个核苷酸变异。本实验中所构建的突变体库包含丰富的遗传变异,为开展大豆疫霉病菌的功能基因组研究奠定了遗传材料基础,对后续的相关功能分析具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 疫霉菌的危害性
• 1.2 全基因组测序
• 1.3 大豆疫霉菌生物学特性
• 1.4 基因组学的研究（突变）
• 1.4.1 自发突变的收集及利用
• 1.4.2 物理突变
• 1.4.3 化学突变
• 1.4.4 EMS
• 1.4.5 突变检测方法
• 1.5 反向遗传学
• 1.5.1 反向遗传学概述
• 1.5.2 反向遗传学技术在疫霉菌中的应用
• 1.6 TILLING
• 1.6.1 原理及流程
• 1.6.2 优势及重要性
• 1.6.3 TILLING 技术的应用
• 1.6.4 研究的关键技术
• 1.7 本实验所采用的技术，目的和意义
• 第二章 突变体库的建立
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 大豆疫霉菌培养及其保存方法
• 2.2.2 游动孢子制备
• 2.2.3 化学诱变
• 2.2.4 化学突变体的制备
• 2.2.5 部分突变体的遗传分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 EMS 诱变剂对大豆疫霉菌休止孢萌发的影响
• 2.3.2 EMS 诱变获得形态变异多样的突变体
• 2.3.3 部分突变体的遗传分析
• 第三章 突变体库分析
• 3.1 CEL I 酶粗提液的制备
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 CEL I 酶的粗提液
• 3.1.3 SDS-PAGE 检测
• 3.1.4 CEL I 酶粗提液活性检测
• 3.1.5 结果与分析
• 3.2 突变体筛选
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 PsPMA1
• 3.2.3 PCR
• 3.2.4 错配位点酶切
• 3.2.5 突变检测
• 3.2.6 结果与分析
• 第四章 结论与创新点
• 4.1 结论
• 4.2 创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介