柑橘及其近缘属植物DNA条形码研究

论文摘要

DNA条形码技术（DNA Barcoding）是一种利用短的DNA片段对物种进行识别和鉴定的分子生物学技术,它作为一种新兴的分类学研究技术,近年来引起了越来越多的生物学家的关注。DNA条形码技术的原理是根据基因序列的种间遗传变异大于种内遗传变异而实现准确快速的物种鉴定。自2003年加拿大科学家Paul Hebert等提出该技术以来,已在昆虫、鸟类、鱼类等动物及硅藻类和原核生物中成功应用。在动物的DNA条形码研究中,线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（COI）基因片段已被最成功地用于新种的发现和隐性种的鉴定。然而,COI基因在高等植物中进化速率相对较慢,并不适合作为植物DNA条形码。目前,国内外植物DNA条形码研究还处于寻找合适的基因片段的阶段,许多学者进行了积极的探索,报道了多种植物条形码候选片段或片段组合,但迄今仍没有找到能满足所有标准的DNA条形码特征片段。柑橘属（Citrus L.）由林奈1753年订立,系芸香科（Rutaceae）、柑橘亚科（Aurantioideae）植物。根据雄蕊数目及汁胞构造的不同,Swingle和Reece（1967）将柑橘属及其近缘的五个属,枳属（Poncirus Raf.）、金柑属（Fortunella Swingle）、澳枳檬属（Microcitrus Swingle）、澳沙檬属（Eremocitrus Swingle）和多蕊橘属（Clymenia Swingle）一起划归为真正柑橘果树类。在过去250余年的时间里,国内外学者对柑桔及其近缘属植物的分类和系统发生问题从形态到分子开展了一系列研究。然而,由于研究方法和使用的证据的不同,不同学者得到了不同的研究结论,造成了柑橘分类在亚属划分和种的数目等关键问题上分歧依然很大。准确地弄清柑橘及其近缘属植物之间的系统进化关系,对有关的物种进行准确、快速的识别和鉴定,对未来柑橘属植物的遗传育种,种质资源的深入研究、保护和利用都具有重要的理论和实践价值。本论文以真正柑橘果树类6属植物59个生物类型为研究材料,用matK、rpoB、rpoC1、trnG-trnS、psbH-petB、trnL-trnF等六个叶绿体片段和细胞核ITS序列作为候选基因片段,分别分析了这些候选片段在真正柑橘果树类6属间和柑橘属内物种的识别能力,试图为植物界的DNA条形码研究提供新信息。基于遗传距离分析了真正柑橘果树类属间及柑橘属内种间种内变异,讨论了各片段及片段组合作为该类群植物条形码的适应性。结果显示,在遗传距离方面,ITS序列表现出作为该类群植物条形码的潜力。我们还以九里香（Murraya paniculata L.）、蚝壳刺（Severinia buxifolia （Poir.） Tenore）和酒饼簕（Atalantia buxifolia （Poir.） Oliv.）作为外类群,利用PAUP计算机软件分别用MP法、NJ法和UPGMA法,使用七个单片段和三个组合（ITS+matK、matK+trnG-trnS+psbH-petB、matK+rpoB+rpoC1）分别构建了系统进化树,讨论了候选片段鉴定属的能力；以枳（P. trifoliata（L.）Raf.）、富民枳（P. polyandra S. Q. Ding, X. N. Zhang, Z. R.Bao & M. Q. Liang）和飞龙枳（P.trifoliata var. monstrosa （T. Ito） Swing.）为外类群,讨论各候选片段鉴定柑橘属内种的能力。结果显示,所有候选条码的属和属内种的物种鉴定率都较低,不能完成对该类群植物的准确鉴定。最后,我们重点讨论了ITS、matK和片段组合等作为柑橘及其近缘植物条形码的可能性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 植物DNA条形码研究
• 1.1.1 DNA条形码的概念及发展历史
• 1.1.2 DNA条形码的标准及优点
• 1.1.3 DNA条形码操作及分析方法
• 1.1.4 DNA条形码的研究进展
• 1.1.5 问题与展望
• 1.2 柑橘及其近缘属植物间的分类和谱系进化关系
• 1.3 柑橘属植物的分类及物种划分问题
• 1.3.1 柑橘属植物分类系统
• 1.3.2 柑橘属植物分类研究现状
• 1.3.3 柑橘属（Citrus L.）植物亚属的划分和种的数目问题
• 第2章 引言
• 2.1 论文研究的目的和意义
• 2.2 论文研究的技术路线
• 第3章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总DNA的提取
• 3.2.2 ITS区基因扩增、克隆和测序
• 3.2.3 叶绿体片段扩增及测序
• 3.2.4 数据分析方法
• 第4章 结果与分析
• 4.1 候选片段及其序列特征
• 4.1.1 叶绿体基因组候选片段及其序列特征
• 4.1.2 ITS片段及其序列特征
• 4.2 基于遗传距离分析六属属间及柑橘属内种间和种内变异
• 4.2.1 真正柑橘果树类植物属间遗传变异
• 4.2.2 柑橘属内种间和种内遗传变异分析
• 4.2.3 柑橘属内种间不同片段变异wilcoxon秩和检验
• 4.3 系统发育关系分析评价鉴定效率
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 遗传距离比较与DNA条形码筛选
• 5.2 DNA条形码技术与物种鉴定
• 5.3 matK片段的适应性
• 5.4 核基因ITS的适应性
• 5.5 片段组合方案
• 5.6 研究的不足与展望
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢
• 发表论文和参研课题