论文摘要
苏云金芽胞杆菌（Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于其在芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白。杀虫晶体蛋白结构和作用机制是目前国内外Bt研究的热点;在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上,可以通过分子设计来改变杀虫晶体蛋白的活性和杀虫谱,为转基因植物或微生物提供新的基因来源。本论文围绕苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7的同源建模、分子设计、突变蛋白的机理变化等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:通过重叠引物PCR进行定点突变,得到Cry1Ca的13个突变体,在大肠杆菌BL21中进行了表达,并对甜菜夜蛾进行了生物活性的测定。结果表明绝大部分突变毒蛋白活性降低了,位于DomainⅡ内的突变是439GGT440、N306R、W376F和P375F&P377Y;位于DomainⅢ内的突变是F580S、R522E和R570G;只有位于DomainⅠ中的2个突变蛋白,R148G和F177S,产生了活性提高的突变毒蛋白,前者的活性是Cry1Ca7的6倍,后者的活性是Cry1Ca7的2倍,其它突变的活性都降低了G138S, T221R, T221D和N251S。通过引入限制性内切酶位点的方法得到Cry1Ca结构域增加和减少的突变体,对甜菜夜蛾进行了杀虫活性测定; D1123和D1231保持活性。D12.3a和D12.3b/c的活性完全丧失了。将cry1Ca7半长突变基因F177S连接到本实验构建的载体CT-pSTK上,在Bt转化体系中进行表达,得到全长表达的BtF177S;另外,通过重叠引物PCR的方法,获得全长表达的BtF580S。生测结果发现,BtF177S的活性与Cry1Ca相当,而BtF580S几乎完全丧失了活性。通过高效液相色谱的方法纯化了Cry1Ca7、BtCry1Ca7+CT、BtF177S和BtF580S四种蛋白,与BBMV进行了竞争结合实验和寡聚化实验。通过竞争结合实验可以看出,两种突变蛋白的结合明显比Cry1Ca7要弱些;通过寡聚化实验可以看出,突变蛋白与Cry1Ca7一样,可以形成寡聚化。将cry1Fa2全长基因连接在pSTK上,并转化了苏云金芽胞杆菌无晶体突变株,得到的Cry1Fa2进行对甜菜夜蛾和棉铃虫分别进行生物活性测定,发现,Cry1Fa2的活性对甜菜夜蛾只达到Cry1Ca7的1/12,而对棉铃虫的活性只达到Cry1Ac的1/10。Bt杀虫晶体蛋白分子设计在Bt应用和杀虫作用的分子机理研究方面具有理论意义和实用价值。通过对Cry1Ca7进行分子设计,获得了活性提高的突变蛋白,为转基因植物或微生物提供了新的基因资源;活性降低的突变蛋白可以作为材料用来做机理方面的基础研究。