重组腺病毒介导DN-JNK1预防SD大鼠非酒精性脂肪性肝病及机理研究

论文摘要

第一部分SD大鼠非酒精性脂肪性肝病模型的构建及形成机制探讨目的:建立SD大鼠胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）非酒精性脂肪性肝病（non alcoholic fatty liver disease,）模型,并探讨高脂饮食诱导SD大鼠形成NAFLD的分子机制。方法:雄性SD大鼠64只,随机分为正常饮食组（NG,n=32）和高脂饮食组（HG,n=32）。NG大鼠喂饲普通饲料,HG大鼠喂饲高脂饲料,持续喂养8周。分别于1、4周末随机从两组各抽取8只大鼠,正糖高胰岛素钳夹实验（钳夹实验）检测胰岛素敏感性,以判断IR程度,处死后留取肝组织标本,用Western Blot技术检测肝组织c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）蛋白表达和胰岛素受体底物1丝氨酸307(IRS-1Ser307)磷酸化水平。8周末随机从两组各抽取8只大鼠,进行钳夹实验,其余大鼠抽取门静脉血检测血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、空腹血糖（FBS）和空腹胰岛素（FINS）,处死后留取肝组织标本观察造模情况,检测肝匀浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和游离脂肪酸（FFAs）,Western Blot技术检测肝组织JNK1蛋白表达和IRS-1Ser307磷酸化水平。结果:HG大鼠GIR水平降低,JNK1蛋白表达和IRS-1Ser307磷酸化水平增高,均呈明显时间依赖性,两两比较有显著性差异（均p<0.05）,而NG大鼠各时期GIR水平、JNK1蛋白表达和IRS-1Ser307磷酸化水平无明显差异（均p>0.05）;与NG相比,8周末HG大鼠出现IR和肝脂肪变性,体重、肝指数、TG、TC、ALT、AST、MDA、TNF-α、FFAs和FINS水平明显增高,SOD明显降低,JNK1蛋白表达和IRS-1Ser307磷酸化水平增强,比较均有显著性差异（均p<0.05）;两组大鼠血清FBS水平无明显差异（p>0.05）。结论:高脂饮食饲养SD大鼠8周可成功构建NAFLD模型。该模型的特征为IR、高脂血症、高胰岛素血症和转氨酶升高;高脂饮食能诱导TNF-α和FFAs水平升高,产生氧化应激及脂代谢异常,并共同作用于JNK信号通路,激活肝组织JNK1蛋白表达,上调IRS-1Ser307磷酸化水平,诱导和加重IR,导致NAFLD的发生。第二部分应用AdEasy腺病毒载体系统构建DN-JNK1重组腺病毒和功能鉴定目的:制备表达失活型c-jun氨基末端激酶1（c-Jun N-terminalkinase1,JNK1）重组腺病毒（recombinant adenovirus dominant-negativetype JNK1,Ad-DN-JNK1）,并通过动物实验进行功能鉴定。方法:将重组穿梭载体pAdTrack-CMV-DN-JNK1线性化后,与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5138,进行同源重组得到重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体转染入包装细胞HEK293内制备重组腺病毒Ad-DN-JNK1,并经PCR及DNA测序鉴定。Western blot检测Ad-DN-JNK1在SD大鼠肝组织中JNK1蛋白表达和胰岛素受体底物1丝氨酸307(IRS-1Ser307)磷酸化水平。结果.JNK1重组腺病毒载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,5d后可以观察到绿色荧光蛋白明显表达,搜集的病毒经过PCR扩增得到特定JNK1基因片段并对其进行测序鉴定构建成功,所制备的Ad-DN-JNK1滴度为2.5×1010pfu/ml。动物实验显示,感染Ad-DN-JNK1大鼠肝组织JNK1表达明显升高,IRS-1Ser307磷酸化水平明显下降,比较有显著性差异（均p＜0.05）。结论:该研究成功构建了JNK1重组腺病毒载体及相应重组腺病毒颗粒,动物实验证明Ad-DN-JNK1能有效介导DN-JNK1基因蛋白表达,并下调IRS-1Ser307磷酸化水平。为进一步研究JNK的作用及应用Ad-DN-JNK1进行相关疾病的基因治疗奠定了基础。第三部分应用重组腺病毒介导DN-JNK1预防SD大鼠非酒精性脂肪性肝病及机理研究目的:应用重组腺病毒Ad-DN-JNK1表达失活型JNK1基因,探讨其对SD大鼠NAFLD的预防作用及机理。方法:雄性SD大鼠128只,随机分为正常饮食对照（NC）组、高脂饮食对照（HC）组、携带绿色荧光蛋白的腺病毒（Ad-GFP）组和Ad-DN-JNK1组,各组均32只,NC组大鼠予以普通饲料,其余三组予以高脂饲料,均持续喂养8周。实验第一周,NC组和HC组大鼠均从尾静脉注入1ml生理盐水作为安慰剂对照,Ad-GFP组大鼠尾静脉注入1ml 2.5×1010pfu的Ad-GFP作为腺病毒对照,Ad-DN-JNK1组大鼠尾静脉注入1ml 2.5×1010pfu的Ad-DN-JNK1作为实验组。1、4周末分别从四组各随机抽取8只大鼠进行正常血糖—高胰岛素钳夹实验（钳夹实验）,检测INS敏感性,以判断大鼠IR程度,处死后用Western Blot技术检测肝组织JNK1蛋白表达和胰岛素受体底物1丝氨酸307(IRS-1Set307)磷酸化水平。8周末分别从四组各随机抽取8只大鼠,进行钳夹实验。其余大鼠抽取门静脉血检测血清甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、空腹血糖（FBS）和空腹胰岛素（FINS）,处死后留取肝组织检测肝匀浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和游离脂肪酸（FFAs）,Western Blot技术检测肝组织JNK1蛋白表达和IRS-1Ser307磷酸化水平。结果:Ad-DN-JNK1组、HC组和Ad-GFP组大鼠肝组织JNK1蛋白表达均增强,并呈明显时间依赖性,不同时期同组大鼠两两比较均有显著性差异（均p＜0.05）;HC组和Ad-GFP组大鼠GIR水平降低和IRS-1Ser307磷酸化水平升高,均呈明显时间依赖性,两两比较有显著性差异（均p＜0.05）;Ad-DN-JNK1组和NC组大鼠不同时期GIR和IRS-1Ser307磷酸化水平均无明显差异（均p＞0.05）;与HC组和Ad-GFP组相比,8周末Ad-DN-JNK1组和NC组大鼠均未出现明显肝组织脂肪变性和IR,TG、ALT、AST、MDA、TNF-α、FFAs和FINS水平均明显降低,SOD水平增高,IRS-1Ser307磷酸化水平降低,比较均有显著性差异（均p＜0.05）;与NC组比较,8周末Ad-DN-JNK1组、HC组和Ad-GFP组大鼠肝组织JNK1蛋白表达均增强,比较有显著性差异（均p＜0.05）;而Ad-DN-JNK1组和NC组比较,HC组和Ad-GFP组比较,上述各项数据均无显著性差异（均p＞0.05）。同时,大鼠注射腺病毒后均未出现皮肤等任何过敏反应、死亡等现象。结论:Ad-DN-JNK1是失活的JNK1蛋白,由于JNK通路被阻断,IRS-1Ser307磷酸化被抑制而延缓了IR,最终延缓了NAFLD的发生和发展。腺病毒载体是一种安全有效的基因载体,重组腺病毒DN-JNK能够安全应用于SD大鼠IR NAFLD发病机制的研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一部分 SD大鼠非酒精性脂肪性肝病模型的构建及形成机制探讨
• 1.1 前言
• 1.2 材料和方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二部分 应用AdEasy腺病毒载体系统构建DN-JNK1重组腺病毒和功能鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三部分 应用重组腺病毒介导DN-JNK1预防SD大鼠NAFLD及机理研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果