论文摘要
目的:我国胃癌的患病率及死亡率均超过世界平均水平两倍。超过半数以上胃癌患者在发现时已处于晚期,甚至失去手术机会,治疗多依靠化疗等手段。目前胃癌化疗尚无金标准规范方案可循,且多年来疗效获益改善有限。顺铂是各期胃癌化疗的基石药物,但单药或联合用药的有效率均不超过20%,肿瘤原发或获得性耐药致使其疗效不佳或由有效转为无效。胃癌对顺铂的耐药是一个多基因、多步骤和多因素的复杂过程。阐明胃癌顺铂耐药的机制,提高其临床应用价值,改善患者预后及生存,是胃癌治疗的重点。E-钙粘蛋白（E-cadherin）是粘附分子超家族成员,介导细胞-细胞、细胞-基质间的紧密连接。E-cadherin是细胞上皮间质改变（epithelial to mesenchymal transition,EMT）的重要参与因子,可参与肿瘤增殖凋亡及侵袭转移等多种生物学行为的调节,其作为侵袭转移抑制因子已得到确认。近年来研究揭示E-cadherin还可影响肿瘤细胞对包括顺铂（cisplatin,DDP）在内的多种细胞毒药物及靶向治疗的药物敏感性,但相关机制研究主要集中于其对凋亡相关基因BCL-2表达的调节,且结论尚不统一。在胃癌中的研究发现,E-cadherin在胃癌组织中低表达或缺失,且E-cadherin高表达可抑制胃癌的局部浸润及远处转移。因此,E-cadherin在胃癌的发生发展中可能发挥抑癌基因样的作用。但目前关于E-cadherin与胃癌顺铂耐药的关系研究尚未见报道。本研究将以胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP及其敏感株SGC7901为模型,二者具有相同的遗传学背景。我们发现E-cadherin mRNA及蛋白在两株细胞间存在表达差异,其在SGC7901/DDP细胞中表达显著减低。因此,我们应用siRNA干扰技术在E-cadherin高表达的SGC7901细胞中进行loss-of-function功能研究,明确E-cadherin对胃癌顺铂耐药性的影响,并对其相关机制进行初步探讨。为理解胃癌顺铂耐药机制进一步提供理论基础,对于胃癌的治疗干预及新治疗靶点的发掘具有重要的科学意义。方法:培养胃癌顺铂耐药细胞SGC7901/DDP及其敏感细胞株SGC7901,应用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测两株细胞对顺铂药物敏感性的差异,应用RT-PCR、Western blot印迹法检测两株细胞间E-cadherin mRNA及蛋白水平的表达。设计合成特异性针对E-cadherin的干扰序列siRNA及其阴性对照序列,按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书将E-cadherin siRNA及阴性对照序列瞬时转染入SGC7901细胞,转染24、48、72h后以RT-PCR、Western blot分别检测E-cadherin mRNA及蛋白的表达情况,检测干扰效果。转染24h后细胞用于药敏研究,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性改变,转染72h后细胞提取细胞总蛋白,应用Western blot检测细胞中BCL-2和BAX蛋白水平表达的改变。结果:1胃癌顺铂耐药细胞系SGC7901/DDP对顺铂的IC50为:11.245±0.272 mg/L,敏感株为:2.206±0.256 mg/L。SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性显著高于SGC7901细胞（P<0.05）。2 E-cadherin mRNA在SGC7901/DDP细胞中的相对表达量为:0.029±0.018,在SGC7901细胞中的相对表达量为:0.364±0.040。E-cadherin蛋白在SGC7901/DDP细胞中的相对表达量为:0.098±0.030,在SGC7901细胞中的相对表达量为:0.498±0.020。SGC7901/DDP细胞与SC7901细胞相比,E-cadherin mRNA及蛋白表达均显著减低（P<0.05）。3 SGC7901细胞转染E-cadherin siRNA 24、48、72h后细胞中E-cadherin mRNA的相对表达量分别为:0.168±0.016、0.109±0.020和0.048±0.014,阴性对照组为:0.414±0.025。转染后24、48、72h细胞中E-cadherin蛋白的相对表达量分别为:0.244±0.006、0.155±0.007和0.118±0.014,阴性对照组为:0.527±0.006。siRNA转染后E-cadherin mRNA及蛋白表达水平较阴性对照组均显著减低（P<0.05）。E-cadherin siRNA干扰序列可达到良好的沉默效果。4 SGC7901细胞转染E-cadherin siRNA后对顺铂的IC50为:4.375±0.199mg/L;阴性对照组为:2.882±0.166mg/L。转染E-cadherin siRNA细胞对顺铂的敏感性显著低于阴性对照组（P<0.05）,转染E-cadherin siRNA后SGC7901细胞呈现出耐药表型。5转染E-cadherin siRNA 72h后SGC7901细胞中BCL-2蛋白的相对表达量为:0.328±0.014,阴性对照组为:0.114±0.012;而BAX蛋白的相对表达量在E-cadherin siRNA转染组为:0.139±0.013,阴性对照组为:0.369±0.016。SGC7901细胞转染E-cadherin siRNA 72h后BCL-2蛋白表达显著增高而BAX蛋白表达显著减低（P<0.05）。结论:1胃癌细胞顺铂耐药表型与E-cadherin表达缺失有关,E-cadherin可能是参与胃癌耐药的新的机制。2抑制E-cadherin表达可促进胃癌SGC7901细胞对顺铂耐药的发生。3 E-cadherin siRNA诱导的胃癌细胞耐药表型与上调抑凋亡基因BCL-2的表达和抑制促凋亡基因BAX的表达有关。