冯林
泸州医学院附属医院血液科四川泸州646000
【摘要】目的：研究沙利度胺对于M7细胞（巨核细胞白血病细胞）的作用。方法：用Sigma公司生产的沙利度胺原料药。以0.1%DMSO（二甲基亚砜）为阴性对照组，以M7细胞为空白组，以不同浓度的沙利度胺作用于M7细胞，用CCK-8方法（细胞计数试剂盒方法）观察不同浓度不同时间沙利度胺对于M7细胞的增值抑制作用；以不同浓度沙利度胺分别作用M7细胞24h,48h,72h后，用ELISA方法检测上清液中VEGF（血管内皮生长因子）的浓度；以不同浓度沙利度胺分别作用M7细胞24h,48h,72h后，经HE及DAPI（二脒基苯基吲哚）染色后，用光学显微镜及荧光显微镜观察M7细胞形态变化，并应用统计学分析实验结果。结果：沙利度胺可明显抑制M7细胞分泌VEGF，并且抑制作用随着沙利度胺浓度及作用时间而增强；在CCK-8实验中，各组M7细胞与空白组相比，发现沙利度胺对M7细胞无明显抑制作用；光学显微镜观察不同时间段不同组，各组M7细胞与空白组相比较，细胞生长较好，呈圆形，细胞核大，核膜清晰。荧光显微镜下，未见明显凋亡小体。结论：1.沙利度胺能够明显抑制M7细胞分泌VEGF，并且呈时间浓度依赖性。2.沙利度胺对于M7细胞没有明显抗增殖效应及诱导其凋亡的作用。
【关键词】沙利度胺；VEGF；M7细胞;凋亡小体；DAPI染色
【中图分类号】R52.5【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）9-0566-02
【Abstract】Objective：ToresearchontheimpactofthalidomideonM7cellline.Methods：ThalidomideusedascrudedrugwasboughtfromSigmacompany.Take0.1%DMSOasthenegetivecontrolgroup,andM7cellsasblankgroup,totreatM7cellwiththalidomideofdifferentconcentrationandchecktheproliferativeinhibitionrateofM7cellbyCCK-8;totreatM7cellwiththalidomideofdifferentconcentrationfor24hr,48hrand72hrrespectivelyandchecktheVEGFconcentrationofsupernatantbyElisa;totreatM7cellwiththalidomideofdifferentconcentrationfor24hr,48hrand72hrrespectivelyandchecktheformsandapoptoticstateofM7cellsbylightmicroscopeandfluorescentmicroscopeandanalyzetheexperimentresultsbystatistics.Results：ThalidomidecanremarkablelyinhibittheVEGFsecretedbyM7cellandtheinhibitionincreasesasthetimeandconcentrationgoby.InCCK-8test,tocompareeachsubjectgroupwithblankgroup,wefindthalidomidehasnoremarkableinhibitoryactiononM7cell.Tocompareeachsubjectgroupofdifferenttimeswithblankgroupbylightmicroscopeandfluorescentmicroscope,wefindcellsgrowwellwithroundshape,largenucleusandlimpidnuclearmembranewithHEstainingandthereisnoapparenteapoptoticbodywithDAPIstaining.Discussion：1.ThalidomidecanremarkablelyinhibitVEGFsecretionbyM7cell,andtheinhibitionistimeandconcentrationdependent.2.Thalidomidehasnonotableanti-proliferativeandapoptosis-inducedeffectsonM7cell.
【Keywords】ThalidomideVEGFM7cellApoptiticbodyDAPIstaining
急性巨核细胞白血病（acutemegakaryocyticleukemia,AMKL）是一类较少见的白血病。该病是巨核系细胞恶性增殖所致，具有一般急性白血病的临床表现，主要有贫血、出血、感染、骨痛等症状，常见于3岁以内的幼儿和成年人。特发性血小板减少性紫癜（ITP），是一种获得性自身免疫性疾病，其发病机制目前认为是体液免疫功能障碍是主要致病原因，其中包括抗原递呈细胞、T细胞、和B细胞之间的相互作用，其体液免疫、细胞免疫、和血小板功能的异常已被公认。
1资料与方法
1.1一般资料选取人成巨核细胞白血病株（Meg-01，即M7细胞株）为此次实验的细胞株，该细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2方法M7细胞株培养后，用CCK-8实验测定沙利度胺对M7细胞株抑制作用（用酶联免疫检测仪于450nm波长测定吸光度值（A值），细胞增殖抑制率（%）=（1-）×100%），在450nm测定，按以上公式计算抑制率）；HE及DAPI染色观察细胞生长及凋亡情况；ELISA实验检测细胞上清液VEGF浓度，根据所测得的吸光度OD450值，将不同浓度的标准品按照OD450值绘制与OD450值关系曲线，根据标本的OD值，在曲线上查找相应的VEGF浓度。
1.3统计学处理数据使用SPSS13.0统计软件包进行统计分析。实验数据计算均值、标准差，各组应用方差分析，以a=0.05为检验水准，P<0.05被认为差异有统计学意义。
2结果
2.1沙利度胺能明显抑制M7细胞分泌VEGF。在ELISA方法试验中，检测不同浓度沙利度胺对M7细胞分泌VEGF的影响作用，发现不同浓度沙利度胺对于M7细胞分泌VEGF均有明显抑制作用，且呈时间浓度依赖性。0.1%DMSO组对M7细胞分泌VEGF无明显抑制作用（表1、2、3、4）。
2.2M7细胞经HE及DAPI染色后，光学显微镜及荧光显微镜下观察。不同浓度沙利度胺对不同时间段各组M7细胞形态学改变无明显影响及无明显诱导凋亡的作用，且各组未见明显凋亡小体（图4、5、6）。（注：“A、B”分别代表50ug/ml、25ug/ml浓度沙利度胺，“DMSO”代表DMSO组，“空”代表空白组；数字“1”、“2”、“3”代表24hr,48hr及72hr三个时间段。例：A1表示“24hr时间段50ug/ml沙利度胺组”）
24hr各实验组M7细胞光镜下图片
72hr各实验组M7细胞光镜下图片
2.3CCK-8法检测沙利度胺对M7细胞增值抑制作用。各实验组（24hr,48hr及72hr）CCK-8结果与空白组（24hr,48hr及72hr）相比，A值差异无统计学意义（P>0.05）,沙利度胺对M7细胞无直接抑制作用（表4、5、6）。
3讨论
急性白血病（acuteleukemia）是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。最近的研究发现[1]，实体肿瘤的生长、播散和转移依赖于血管新生，血液系统恶性肿瘤同实体肿瘤类似，可以见到骨髓微血管密度的增加，而这与VEGF的关系十分密切。白血病细胞的髓外浸润是常见的并发症,也是导致白血病患者复发和死亡的重要原因。白血病细胞的髓外浸润是一个多步骤、多因素参与的复杂过程,而血管新生是其中的关键环节。临床上髓外浸润常见于急性淋巴细胞白血病（ALL），Veiga[2]等研究ALL细胞上清液、ALL骨髓基质细胞上清液以及ALL骨髓中分离出的血浆，发现它们都可以诱导血管内皮细胞和骨髓内皮细胞的增生，从而证明了ALL细胞和基质细胞都分泌血管生成调节因子。提示这些血管生成调节因子可能与ALL的髓外浸润有着密切的关系。此外，血液及组织中高水平的VEGF值往往提示预后不良[3]。肿瘤的生长及侵袭有诸多因素，而VEGF及其受体是其中非常重要的一环，干扰VEGF旁分泌或自分泌途径可能是有效地靶点治疗策略。因此找到一种可以有效干扰VEGF分泌的药物则成为了靶点治疗的关键。
近年来，沙利度胺作为一种抑制血管新生的抗肿瘤药物，受到越来越多的关注。在D’Amato、Verheul等[4]试验中，还发现沙利度胺能通过抑制碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，从而减少兔角膜血管的生成。大量试验已经证明沙利度胺可以抑制血管新生，在临床治疗中亦取得一些疗效，但沙利度胺抑制血管新生的作用机制不是完全清楚。抑制促血管生成因子可能是其主要作用，通过阻断刺激VEGF、bFGF等促血管生成因子增值的信号途径[5]，达到抑制血管新生的目的。因此本实验通过体外对M7细胞株施加沙利度胺的影响，研究该药物对急性巨核细胞白血病的作用。肿瘤的发生及肿瘤细胞的增加都伴有新生毛细血管的生成[6]。
综上所述，体外研究表明沙利度胺可能是通过抑制M7细胞VEGF的分泌达到抗血管新生的作用，发挥抗白血病细胞的治疗效应。其抗血管新生的作用具有浓度时间依赖性。但沙利度胺对M7细胞无明显增值抑制及诱导凋亡的作用，这与其他研究结果得出的结论相似[7-9]，沙利度胺抗肿瘤的作用是间接的，推测其主要通过抗血管新生达到抗肿瘤的目的。以上均为体外研究的启示，而动物及人体体内实验仍需进一步研究证明。
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