HS影响B16F10黑色素瘤转移的机制研究

论文摘要

目的:主要从HS对于肿瘤生长,肿瘤血管生成,肿瘤细胞基底膜侵袭作用,肿瘤血行和外渗过程用四个方面的影响,通过一系列体内外实验来探讨HS对于B16F10黑色素瘤转移的影响,并进一步探讨HS发挥作用的机制。方法:1)建立B16F10黑色素瘤（C57BL/6小鼠）自发性转移模型,将小鼠随机分成4组,接种8天后给药,分别腹腔注射给予生理盐水、HS 5.2mg/kg/day,HS11.6mg/kg/day,HS 26mg/kg/day,连续38天。第23天切除荷瘤足部,观察HS对原发瘤增殖的影响;接种肿瘤第46天处死动物取肺,称重并计算肺表面的转移结节数进而评价其抗肿瘤转移作用效果;采用MTS比色法研究HS对于B16F10细胞以及HUVEC增殖的影响,以评价HS体外抑制肿瘤转移活性以及为后面的体外实验剂量确定提供依据。2)采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移及小管形成模型研究HS体外抗血管生成作用;以鸡胚绒毛尿囊膜实验模型和基质胶栓（Matrigel Plug）实验模型来研究HS对体内血管生成的影响;全面评价HS对血管生成的影响。3)建立B16F10黑色素瘤（C57BL/6小鼠）实验性肺转移模型,将小鼠随机分为4组,分别腹腔注射给予生理盐水、HS 5.2mg/kg/day,HS11.6mg/kg/day,HS 26mg/kg/day,连续23天,第23天处死动物取肺,称重,统计后评价HS对B16F10细胞血行过程以及穿出血管过程的影响;体外采用改良的Boyden小室法研究HS对B16F10细胞基底膜侵袭能力的影响。4)采用免疫蛋白印记法分析HS对B16F10细胞分泌的MMP-2,MMP-9,VEGF等几个细胞因子表达,免疫组化法测定自发性肿瘤转移原发肿瘤组织内CD34、VEGF、MMP-2、MMP-9等因子的表达,从而进一步探讨HS对肿瘤转移的机制。结果:1)B16F10黑色素瘤自发性肺转移模型结果表明,对的影响,与对照组相比,HS各剂量组的肺转移结节数明显减少（P＜0.05）,且与剂量呈相关性。与对照组相比,HS 26mg/kg剂量组的肺重明显低于对照组的肺重（P＜0.01）,其他两组无明显作用,HS对于接种B16F10黑色素瘤细胞后的小鼠足垫部的原发位肿瘤无论是体积以及重量都没有明显的影响,各给药组小鼠体重增加幅度与对照组相当;MTS结果显示,HS在剂量1μM-100μM之间均能抑制B16F10细胞增殖,其他剂量结果无统计学意义,而HS在剂量高达50μM时才会对HUVEC的正常生长有明显的抑制作用（P＜0.01）,其他各剂量组无论从形态上还是实际测得的吸光度对HUVEC细胞的正常生长均无显著的影响2)与阳性VEGF对照组相比,HS在剂量为2μM（P＜0.05）、10μM（P＜0.05）和50μM（P＜0.01）时均会抑制VEGF诱导的HUVEC增殖,其他的剂量组无显著性的影响;HUVEC迁移实验表明,HS 2μM、10μM、50μM、作用与VEGF诱导的HUVEC后,细胞的迁移运动明显被抑制,迁移过膜的细胞明显减少,与VEGF组相比有明显差异（P＜0.05）;与VEGF对照组相比,HS（0.4μM,P＜0.01;2μM,P＜0.01;10μM,P＜0.01;HS50μM,P＜0.01）剂量依赖性抑制VEGF诱导的HUVEC小管形成,0.08μM对VEGF诱导的小管形成没有影响;大鼠主动脉环血管生成实验结果显示,从实验第7天管腔结构计数数据得出,HS高剂量50μM能够明显抑制管腔结构的形成（P＜0.01）,其余各给药组无显著意义,这可能是由于50μM HS对内皮细胞细胞毒性作用所致,但从动脉环照片可以看到HS对于血管芽生作用有一定抑制作用但是作用不显著;HS剂量依赖性抑制鸡胚尿囊膜上新生血管数,HS中剂量组（50μg/鸡蛋）和HS高剂量组（100μg/鸡蛋）给药载体周围血管支点数明显少于生理盐水组,HS低剂量组（25μg/鸡蛋）无影响;Matrgel Plug实验可以看到HS中剂量（5.2mg/kg/day）和高剂量组（26mg/kg/day）的Plug颜色明显比对照组苍白,Matrigel Plug中血红蛋白含量的测定结果显示给药组（5.2mg/kg/day和26mg/kg/day）血红蛋白含量明显低于对照组（P＜0.01）。3)B16F10细胞Matrigel侵袭实验表明HS0.5μM显著抑制B16F10细胞侵袭作用（P＜0.01）,抑制率达33%,HS 0.004μM,0.02μM,0.1μM也能明显抑制B16F10细胞的侵袭能力（P＜0.05）,呈量效关系;B16F10黑色素瘤实验性转移模型结果显示,与模型组相比,HS高剂量组（26mg/kg）和中剂量组（11.6mg/kg）均能显著减轻小鼠肺组织重量。各给药组小鼠死亡率与对照组比较无明显差别,小鼠体重未发生明显减少现象。4)B16F10黑色素瘤细胞MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表达随着HS剂量增加有减少的趋势,HS0.5μM最为明显,MMP-2,MMP-9和VEGF表达显著减少;HS抑制B16F10自发性肿瘤转移原发瘤中MMP-2,MMP-9和VEGF,CD34表达,降低微血管密度（MVD）。结论:HS毒副作用很小,对B16F10黑色素瘤转移有很好的抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞对基底膜的侵袭作用两个方面,HS能够下调与肿瘤血管生成相关的VEGF表达并降低微血管密度以及下调与肿瘤细胞侵袭作用密切相关的MMP-2和MMP-9表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 前言
• 第一部分 HS对B16F10黑色素瘤自发性转移以及原发瘤生长的影响
• HS对自发性B16F10黑色素瘤转移模型的影响
• HS对细胞增殖作用的影响
• 讨论
• 第二部分 HS对体内外血管生成的影响
• HS对VEGF诱导的HUVEC增殖作用的影响
• HS对VEGF诱导的HUVEC细胞迁移的影响
• HS对VEGF诱导的HUVEC管腔结构形成影响
• HS对VEGF诱导的大鼠动脉环血管形成的影响
• HS对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成的影响
• HS对MATRIGEL PLUG血管生成的影响
• 讨论
• 第三部分 HS对B16F10黑色素瘤细胞血行转移过程以及侵袭力的影响
• HS体外对B16F10细胞基底膜侵袭力的影响
• HS对B16F10黑色素瘤细胞实验性肺转移影响
• 讨论
• 第四部分 HS对B16F10黑色素瘤转移过程MMP-2,-9,VEGF以及微血管密度的影响
• HS体外对B16F10细胞MMP-2,MMP-9和VEGF蛋白表达的影响
• 34表达的影响'>HS体内对于B16F10黑色素瘤自发性转移模型原发瘤MMP-2,MMP-9,VEGF以及CD₃₄表达的影响
• 讨论
• 实验总结
• 文献综述
• 第四部分 附录
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢