论文摘要
灰飞虱Laodelphax striatellus（Fallen）属于半翅目、飞虱科,是一种主要分布在温带和亚热带地区的重要农业害虫。它可以危害多种禾本科作物包括水稻、小麦、大麦和玉米等,不仅可以通过刺吸式口器吮吸汁液损害作物,还可以通过传播植物病毒病大面积危害作物,例如传播水稻条纹叶枯病和黑条矮缩病。灰飞虱在过去只是一种次要害虫,一般不进行针对性防治。但是,近十多年来,灰飞虱在江浙一带区域性地频繁暴发,给当地的农业生产带来巨大的经济损失。灰飞虱的防治主要依靠化学防治。目前,江、浙等地的灰飞虱对多种杀虫剂已经产生了抗药性,抗药性导致药剂防效降低,这是灰飞虱严重危害的因素之一,因此灰飞虱的抗性治理急需解决。毒死蜱是作用于乙酰胆碱酯酶的有机磷杀虫剂,溴氰菊酯是作用于电压门钠离子通道的拟除虫菊酯类杀虫剂。目前这两种杀虫剂分别是防治稻田和麦田灰飞虱的主打药剂,具有优良的防治效果。本文以选育的毒死蜱和溴氰菊酯抗性品系、敏感恢复品系和田间品系为试验材料,系统地研究了毒死蜱和溴氰菊酯的抗性发生、交互抗性及抗性机理,对灰飞虱解毒代谢酶进行了转录组分析,并确定了 2种药剂的抗性相关解毒基因,为进一步弄清灰飞虱对不同杀虫剂的抗性演化机制及制定有效的治理措施提供了理论依据。一、灰飞虱抗感品系的选育及抗性风险评估本研究用毒死蜱和溴氰菊酯对来自江苏建湖田间灰飞虱种群进行连续筛选25代和30代,分别得到对毒死蜱和溴氰菊酯的高抗品系JH-chl和JH-del。与同时进行室内恢复的敏感品系相比,抗性分别达到158.5倍和1072.0倍。JH-chl品系在筛选的前14代抗性上升较慢,从15代之后抗性迅速增加。JH-del品系在筛选过程中抗性稳步增加,没有浮动。田间品系经过20代以上的室内恢复,对毒死蜱和溴氰菊酯均表现出敏感度下降,并保持相对稳定。利用抗性筛选资料统计JH-chl和JH-del品系对毒死蜱和溴氰菊酯的抗性现实遗传力分别是0.102和0.061,预期在施药剂量为杀死种群70%-80%时,灰飞致对毒死蜱和溴氰菊酯的抗性上升10倍分别需要20-22代和22-27代。这表明灰飞虱对毒死蜱和溴氰菊酯的抗性风险均较低,但是灰飞虱对毒死蜱抗性发展速率高于溴氰菊酯。二、灰飞虱抗性品系的交互抗性及抗性稳定性灰飞虱筛选的毒死蜱品系和溴氰菊酯品系与其他常用杀虫剂的存在交互抗性。毒死蜱品系与其他胆碱酯酶抑制剂类杀虫剂（灭多威、丁硫百克威、二嗪磷和乙酰甲胺磷）有显著的交互抗性,与菊酯类杀虫剂溴氰菊酯也有一定的交互抗性,而与绝大多数非同类杀虫剂,如吡虫啉、阿维菌素、甲维盐、吡蚜酮、噻嗪酮和氟铃脲,无交互抗性。溴氰菊酯抗性品系与同类杀虫剂氰戊菊酯存在高水平交互抗性,与部分胆碱酯酶抑制剂类杀虫剂（毒死蜱、灭多威和丁硫克百威）存在低水平交互抗性,而与大部分非同类杀虫剂,如二嗪磷、乙酰甲胺磷、吡虫啉、阿维菌素、甲维盐和噻嗪酮,没有交互抗性。灰飞虱抗性品系显示的交互抗性,可能涉及到靶标不敏感性和解毒代谢能力的加强。此外,毒死蜱和溴氰菊酯高抗品系虽然短期内无法恢复敏感性,但停止筛选可以使抗性明显下降,由此认为两种杀虫剂的抗性并不稳定,生产上可以通过杀虫剂的轮用等抗性治理措施来延缓抗性的发展。三、灰飞虱抗毒死蜱的生化机理研究本章利用活体增效试验测试了 PBO、TPP和DEM对毒死蜱的增效作用,结果显示,三种增效剂在敏感品系JHS中的增效均不明显,PBO和TPP在田间品系JHF中略有增效,在毒死蜱抗性品系JH-chl中增效显著,增效比分别是2.81倍和3.47倍,但DEM仍没有增效作用。对不同品系进行酶活力测试的结果显示,JH-chl的多功能氧化酶和酯酶活力分别比JHS的增加了 4.65和3.34倍,而谷光甘肽转移酶、碱性和酸性磷酸酯酶的活力没有明显的差异。JHF的细胞色素P450、酯酶、谷光甘肽转移酶、碱性和酸性磷酸酯酶的活力与JHS的没有显著差异。灰飞虱乙酰胆碱酯酶的动力学和抑制试验结果显示,JH-chl乙酰胆碱酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax值比JHS的分别增加了 5.96倍和3.34倍,而JHF的与JHS的差异不显著。以敌敌畏、丙溴磷、氧化毒死蜱和乙酰甲胺磷作为乙酰胆碱酯酶的抑制剂时,JHS和JHF之间的抑制中浓度IC50和抑制常数Ki的值没有明显的变化,但JH-chl的乙酰胆碱酯酶显示出不敏感性,其抑制常数IC50显著升高（3.27-8.27倍）,抑制常数Ki值显著降低（0.17-0.35倍）。综合以上结果认为,灰飞虱对毒死蜱的抗性机制涉及到多功能氧化酶和酯酶解毒活力的升高,以及靶标乙酰胆碱酯酶的敏感性降低。四、灰飞虱抗溴氰菊酯的生化机理及靶标机制分析通过活体增效试验测定了 PBO,TPP和DEM在不同抗性水平的溴氰菊酯抗性品系中对溴氰菊酯的增效作用,结果表明PBO和TPP在JH-del-G30品系（RR=1072倍）中增效显著,增效比分别为2.43倍和1.86倍。DEM在不同品系中均没有明显地增效作用。酶活力测定表明,JH-del-G30、JH-del-G4（RR=106倍）和F-G1品系（RR=63倍）的总酯酶活力分别是敏感品系JHS的15.23、2.29和1.50倍;P450的活力则分别是7.64、2.84和2.19倍;谷光甘肽S-转移酶活力没有显著变化。克隆JHS和JH-del-G30试虫体内的钠离子通道基因抗药性主要突变区段进行序列对比分析,没有发现抗药性相关的基因突变,比较JH-del-G30和JHS品系的钠离子通道基因的表达量,发现表达量也没有显著差异。因此推断灰飞虱对溴氰菊酯的抗性与钠离子通道基因变异无关,主要是P450和酯酶解毒活力上升所致。五、灰飞虱解毒酶基因的鉴定以及抗性相关基因的筛选利用灰飞虱的转录组数据注释搜寻解毒酶基因,获得80条P450、56条羧酸酯酶、63条磷酯酶和13条谷光甘肽转移酶基因的转录本。继而采用RT-PCR技术从灰飞虱体内成功克隆出71条P450、39条羧酸酯酶（CE）、54条磷酸酯酶（PE）和12条谷光甘肽转移酶（GST）的cDNA片段。将这些序列与NCBI的nr数据库进行比较发现,它们与其他昆虫的解毒酶基因序列具有高度的相似性,属于相应的基因家族。利用半定量RT-PCR技术比较这176个解毒酶基因在抗、感灰飞虱品系中的转录水平,结果发现毒死蜱抗性品系JH-chl中有3个P450基因和1个酯酶基因的表达量上调,溴氰菊酯抗性品系JH-del-G30中有5个P450基因和1个酯酶基因的表达量显著上调,其余的P450家族基因、磷酸酯酶和谷光甘肽转移酶的基因表达量没有显著地变化。荧光定量 PCR证实 JH-chl中 CYP6AY3v2、CYP306A2v2、CYP353D1v2和LSCE36的表达量分别是敏感品系的7.07、6.87、12.14和10.20倍,JH-del品系的 CYP439A1v3、CYP6AY3v2、CYP314A1v2、CYP6FU1、CYP353D1v2 和LSCE12的表达量是敏感品系的4.68、24、2.36、16、5.33和11.10倍,这些抗性品系过表达的基因在田间品系F-G1与敏感品系之间没有表达量的显著差异。因此,解毒酶基因的表达数据与酶活力和增效剂的实验结果完全一致,表明P450和酯酶基因的过表达是灰飞虱对毒死蜱和溴氰菊酯产生抗性的主要原因。进而分析灰飞虱抗药性相关基因的拷贝数,发现抗、感品系之间没有明显变化,故可以认为抗药性相关基因的过表达是由于基因转录水平增强而非基因扩增引起。六、灰飞虱抗性相关解毒酶基因的RNAi分析本研究以喂食dsGFP为对照,通过喂食不同抗性基因的dsRNA进行基因干扰,而后利用荧光定量PCR检测干扰试虫的解毒酶基因表达量,并利用药剂生测的方法监测干扰试虫对药剂的敏感性,对灰飞虱的抗性相关解毒酶基因进行了功能验证。结果发现,喂食毒死蜱抗性相关解毒酶基因dsRNA后,灰飞虱JH-chl品系试虫的CYP6AY3v2,CYP306A2v2,CYP353D1 v2 和 LSCE36 基因的表达量比对照分别下降了 56.8%,35.6%,49.77%和48.02%,毒死蜱处理的死亡率明显上升。同样,喂食溴氰菊酯抗性相关解毒酶基因的dsRNA后,灰飞虱JH-del品系试虫的CYP439A1v3,CYP6AY3v2,CYP314A1v2,CYP6FU1,CYP353D1v2 和 LSCE12基因的表达量相应下降了 58.8%,67.35%,63.26%,47.39%,59.79%和 60.59%,溴氰菊酯处理的死亡率也明显升高。由此表明,喂食解毒酶基因的dsRNA可以有效地沉默相应的解毒酶基因,并降低其抗药性,从而证实这些抗药性相关解毒酶基因参与了灰飞虱对毒死蜱和溴氰菊酯抗性的形成。