氟苯尼考胺IgY抗体的制备及ELISA检测方法的建立

论文摘要

氟苯尼考（Florfenicol, FF）为氯霉素类广谱抗生素，与氯霉素（Chloramphenicol,CAP）和甲砜霉素（Thiamphenicol, TAP）相比具有抗菌活性高、无潜在再生障碍性贫血等特点，而成为CAP禁用后的主要替代药物，在兽医临床上得到广泛的应用，但其广泛使用而引起的药物残留也给人们的健康带来了很大的威胁。氟苯尼考胺（Florfenicol amine, FFA）为FF在动物体内最主要的代谢产物，且FF及其大多数代谢产物在酸水解条件下都能转化为FFA。许多国家规定把FFA作为FF的残留标志物，并对两者总的最大残留限量（MRL）做出了相关的规定，因此对FFA的检测就显得十分重要。目前，还缺乏以FFA为检测物的免疫学检测方法，本研究旨在制备抗‐FFA的IgY抗体，从而建立快速检测FFA的间接竞争ELISA（icELISA）方法，已达到同时对FF和FFA总残留的检测。本实验包括以下三部分：1.氟苯尼考胺（FFA）人工抗原的合成及鉴定根据FFA的结构特点，采用戊二醛法将FFA通过一个五碳原子的连接臂与载体蛋白偶联。偶联产物通过紫外-可见分光光度法、SDS-PAGE电泳、非变性凝胶电泳综合鉴定，初步认为FFA人工抗原合成成功。2.抗FFA-IgY抗体的制备及其敏感性检测采用FFA-BSA作为免疫原免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，采用聚乙二醇-6000沉淀法提取IgY抗体。间接ELISA监测抗体效价动态变化，结果表明初免后10d左右产生抗体，随着时间的推移，抗体效价逐渐上升，至初免后60d达到高峰，效价为1:8192，停止加强免疫后抗体效价仍可持续一个月左右。间接阻断ELISA检测抗体的敏感性，1号鸡、2号鸡免疫获得的抗-FFA IgY检测FFA的IC50分别为147.91ng/mL和19.95ng/mL，表明2号鸡提取的抗-FFA IgY敏感性更高。3. FFA间接竞争ELISA免疫学检测方法的建立通过对icELISA法工作条件的优化，建立了快速检测FFA的icELISA检测方法，该方法的标准曲线线性关系良好，相关回归方程为y=-13.71x+64.95（R2=0.945），IC50为12.30ng/mL，与FFA类似物FF和甲砜霉素（TAP）的交叉反应率分别为1.15%和0.13%，表明检测方法的特异性较高。本研究建立了制备FFA人工抗原的方法，获得了产量较高的抗-FFAIgY抗体，并进一步建立了FFAicELISA检测方法，为开发动物可食组织中FFA快速检测ELISA试剂盒奠定了基础。但是本研究获得的抗体效价及敏感性还不够理想，需要从人工抗原的合成及免疫程序的制定等方面进一步改进。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 氟苯尼考概述
• 1.2 氟苯尼考的应用
• 1.3 氟苯尼考的代谢研究
• 1.4 氟苯尼考的危害
• 1.4.1 急性毒性和亚慢性毒性
• 1.4.2 免疫毒性
• 1.4.3 其他毒性
• 1.5 氟苯尼考及其代谢产物残留检测方法
• 1.5.1 微生物学方法
• 1.5.2 色谱分析方法
• 1.5.3 免疫学检测方法
• 1.6 人工抗原合成概述
• 1.6.1 载体蛋白的选择
• 1.6.2 半抗原与载体连接位点的选择
• 1.6.3 半抗原与载体蛋白的偶联
• 1.6.4 连接臂的引入
• 1.6.5 半抗原与载体蛋白的偶联比
• 1.6.6 计算机辅助全抗原合成
• 1.7 IgY 抗体（卵黄抗体）
• 1.8 本研究的目的及意义
• 第二章 氟苯尼考胺人工抗原的合成及鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 主要溶液
• 2.1.3 所需主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 FFA 人工抗原的合成
• 2.2.2 FFA 人工抗原的鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 UV 鉴定结果
• 2.3.2 SDS-PAGE 鉴定结果
• 2.3.3 NAGE 鉴定结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 人工抗原的合成
• 2.4.2 人工抗原的鉴定
• 2.5 小结
• 第三章 氟苯尼考胺 IgY 抗体的制备及免疫学特性鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 主要溶液
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 实验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 动物免疫
• 3.2.2 IgY 抗体的分离纯化
• 3.2.3 间接 ELISA 检测 IgY 抗体效价
• 3.2.4 间接阻断 ELISA 检测 IgY 抗体敏感性
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 IgY 抗体的 SDS-PAGE 电泳
• 3.3.2 抗体效价动态变化
• 3.3.3 IgY 抗体敏感性
• 3.4 讨论
• 3.4.1 抗原剂量的选择及施用途径
• 3.4.2 免疫佐剂
• 3.4.3 IgY 抗体的提取
• 3.4.4 IgY 抗体敏感性的差异
• 3.5 小结
• 第四章 氟苯尼考胺 icELISA 检测方法的建立
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 icELISA 检测 FFA 试验条件优化
• 4.2.2 间接 ELISA 检测 FFA 标准曲线的建立
• 4.2.3 FFA icELISA 检测方法的特异性评价
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 FFA 间接 ELISA 最佳条件
• 4.3.2 间接 ELISA 检测 FFA 标准曲线
• 4.3.3 FFA icELISA 检测方法的特异性
• 4.4 讨论
• 4.4.1 icELISA 检测方法的影响因素
• 4.4.2 与同类研究的比较
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介