鳗弧菌6个毒力基因的多重PCR与基因芯片检测技术的建立以及创新检测技术的初步探索

论文摘要

病原弧菌是一种在世界范围内感染淡、海水鱼类及其它养殖动物的弧菌病,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。主要包括鳗弧菌、灿烂弧菌、创伤弧菌、溶藻胶弧菌和哈维氏弧菌等。其中,鳗弧菌（Vibrio anguillarum）流行区域广泛,其致病性是由许多毒力因子相互作用而形成的一套复杂机制,这些毒力因子包括质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白、胞外蛋白酶、细胞表面成分等。对各种病原鳗弧菌的检测方法有很多报道,主要有免疫荧光抗体技术和核酸杂交技术等,但是免疫荧光抗体技术需要制备抗血清,核酸杂交技术灵敏度只有150pg。随着水产养殖病原信息的不断丰富,水产养殖病原的诊断技术不可避免地向着高通量的方向发展。20世纪90年代发展起来的基因芯片技术,是高通量、平行性、低成本的新型分子生物学技术,是基因功能研究的新一代工具。因此,将该技术应用于水产养殖动物病害的早期诊断对养殖业来说是十分具有意义的。多重PCR是指在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对,从而同时扩增多个序列的反应过程,能够节省时间和精力。为基因芯片诊断的平行性提供保障,为高通量诊断工作提供便利。本文针对基因芯片诊断技术的研究,通过优化多重PCR的反应体系和反应条件,包括Mg2+浓度、引物浓度、热启动酶、退火温度和反应循环数等,建立了一套对鳗弧菌6个毒力基因—vah1、virC、flaA、empA、virA、angM—实现同步扩增的多重PCR和基因芯片技术。作为多重PCR的模板的鳗弧菌总DNA用酚-氯仿抽提法提取,引物和探针的设计是在同一反应条件下,确保Tm值相近、引物间无超过连续4个碱基以上的互补序列、引物内部无发卡结构。在多重PCR反应的优化过程中,设定Mg2+浓度梯度（1.6mM-5.2mM）、引物浓度梯度（0.1μM-1.0μM）、退火温度梯度（50℃-65℃）、循环数梯度（20c,25c,30c,35c,40c,45c）以及不同的Taq酶组合。得到优化后的多重PCR反应体系为：Mg2+浓度3.6 mM,引物浓度-angM 0.1μM, vahl 0.2μM, flaA 0.2μM, empA 0.2μM, virC 0.4μM, virA 1.0μM,退火温度55.5℃,循环数35c。热启动Taq酶的加入对多重PCR体系的特异性和反应效率有显著提高。多重PCR的电泳检测灵敏度可达到16fg目的基因,相当于4个拷贝鳗弧菌基因组DNA。基因特异性引物加入地高辛标记的dUTP扩增以标记鳗弧菌的待测目的片断,标记后的多重PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检查。将合成后的探针按照设定的位置分布用手动点样仪点在尼龙膜上点阵组成寡核苷酸膜芯片。之后将该多重PCR产物配制杂交液与基因芯片进行杂交,显色可观察到鳗弧菌的6个毒力基因基因均能特异性显色,无其它交叉反应,表明本文建立的多重PCR结合基因芯片检测技术可以作为待测样本是否含有鳗弧菌该毒力基因的检测方法。目前,创新的核酸扩增技术广泛的应用于生命科学及其相关的各个领域,对生命科学的发展发挥着巨大的作用。主要包括环介导等温扩增（LAMP）技术；赖解旋酶恒温基因扩增（HDA）技术；固相PCR技术；指数富集配体的系统进化（SELEX）技术；SOLEXA高通量测序技术；Taqman实时荧光定量PCR技术等。本文最后对Taqman实时荧光定量PCR技术、HDA技术、带公用引物接头的固相PCR技术应用于多重PCR和基因芯片技术的前期研究作了初步探索。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 鳗弧菌概述
• 1.1.1 铁吸收系统毒力因子
• 1.1.2 细胞外溶血素毒力因子
• 1.1.3 细菌鞭毛蛋白毒力因子
• 1.1.4 胞外蛋白酶侵袭因子
• 1.1.5 细胞表面成分
• 1.2 多重PCR技术
• 1.2.1 多重PCR技术原理
• 1.2.2 多重PCR技术要素
• 1.2.3 多重PCR技术的进展
• 1.2.4 多重PCR技术在细菌检测中的应用
• 1.3 基因芯片技术
• 1.3.1 基因芯片的产生背景
• 1.3.2 基因芯片的概念和原理
• 1.3.3 基因芯片的应用
• 1.4 核酸扩增新技术
• 1.4.1 环介导等温扩增技术
• 1.4.2 赖解旋酶恒温基因扩增技术
• 1.4.3 固相PCR技术
• 1.4.4 指数富集配体的系统进化技术
• 1.4.5 SOLEXA高通量测序技术
• 1.4.6 Taqman实时荧光定量PCR
• 1.4.7 总结
• 1.5 本文研究目的及研究内容
• 2 多重PCR结合基因芯片检测鳗弧菌的6个毒力基因
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌种来源及引物探针的合成
• 2.1.2 细菌总DNA提取
• 2.2 仪器和设备
• 2.3 多重PCR体系的建立
• 2.3.1 常规PCR反应体系和反应条件
• 2.3.2 多重PCR扩增条件的优化
• 2.3.3 多重PCR灵敏度检测
• 2.4 多重PCR产物与膜芯片的杂交
• 2.4.1 地高辛标记多重PCR扩增目的片断
• 2.4.2 膜芯片的制备
• 2.4.3 预杂交和杂交
• 2.4.4 杂交后显色
• 2.4.5 芯片检测结果的判读
• 2.5 结果
• 2.5.1 单重PCR反应体系及结果
• 2.5.2 多重PCR反应体系的建立
• 2.5.3 多重PCR反应体系的检测灵敏度
• 2.5.4 多重PCR反应产物与膜芯片的杂交
• 2.6 讨论
• 3 新核酸扩增技术检测鳗弧菌6个毒力基因的初步探索
• 3.1 Taqman Real-Time PCR技术
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 结果
• 3.1.4 讨论
• 3.2 固相PCR技术
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.2.3 结果
• 3.2.4 讨论
• 3.3 赖解旋酶等温扩增技术
• 3.3.1 材料
• 3.3.2 方法
• 3.3.3 结果
• 3.3.4 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文