维生素D3增强二甲双胍对小鼠结肠炎相关结肠肿瘤形成的预防作用及其机理研究

论文摘要

目的:研究维生素D3增强二甲双胍对小鼠结肠炎相关结肠肿瘤的预防作用及其作用机制方法:5周龄ICR♂小鼠腹腔注射20mg/kg 1,2-二甲肼（DMH）一次,一周后在小鼠饮用水中添加20g/L的右旋葡聚糖苷钠（DSS）连续饮用一周,制备炎症相关的结肠肿瘤模型。实验动物按体重随机分为7组,分别为空白对照组、DMH单独对照组、DSS单独对照组、模型对照组、VD（66.7、200、600 IU/kg/day）组、二甲双胍（80、240、720mg/kg/day）组以及VD和二甲双胍联合（VD3 200 IU/kg/day +二甲双胍 80 mg/kg/day,VD3 66.7 IU/kg/day + 二甲双胍 240 mg/kg/day,VD3 200 IU/kg/day + 二甲双胍 240 mg/kg/day）给药组。自注射 DMH的第四天开始口服灌胃给药,每天一次,连续给药137天。20周时处死动物,收集大肠和血清样本。观察肉眼可见肿瘤数目,测量每个肿瘤长和宽并计算平均肿瘤体积、抑瘤率,亚甲蓝染色低倍显微镜下观察大肠异常隐窝病灶（ACF）数量、计算ACF得分,组织病理学检查观察所形成的息肉及肿瘤类型。电子血糖仪测小鼠空腹血糖,ELISA法检测小鼠血清胰岛素、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）的含量;Western Blot法检测小鼠结肠组织相关信号通路活化蛋白 Phospho-IGF-I Receptor β（Tyr1135/1136）/Insulin Receptor β（Tyr1150/1151）、Phospho-AMPKα（Thr172）、Phospho-Akt（Ser473）、Phospho-mTOR（Ser2448）、Phospho-p70 S6 Kinase（Thr389）、Phospho-S6 Ribosomal Protein（Ser235/236）和CyclinD1表达的变化。结果:与模型对照组相比,VD3和二甲双胍联合（VD3 200IU/kg/day+二甲双胍240 mg/kg/day）给药能明显减少肿瘤形成数目,缩小平均肿瘤体积,减少ACF形成的数量,减少ACF得分,差别具有显著性。VD3增强二甲双胍预防结肠肿瘤形成的作用机理研究结果:与正常对照组相比,模型对照组血清胰岛素、IGF-1和IGFBP-3浓度明显降低,IGFBP-1浓度明显升高。与模型对照组相比,VD3和二甲双胍联合给药能使血清IGFBP-3浓度明显升高,差别有显著性,但对小鼠空腹血糖、血清胰岛素、IGF-1与IGFBP-1水平没有明显影响。与VD3中剂量组相比,VD3中剂量+二甲双胍中剂量联合用药组小鼠血清中IGFBP-3水平明显升高,差别具有显著性。与正常对照组相比,模型对照组结肠组织中p-AMPK蛋白表达明显降低,p-mTOR、p-P70S6K、p-S6P及CyclinD1蛋白表达明显升高,且差别均具有显著性,p-AKT蛋白表达无明显变化。与模型对照组相比,VD3中剂量+二甲双胍中剂量联合用药组小鼠结肠组织p-AMPK蛋白表达明显升高,p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6P和cyclinD1蛋白表达水平明显降低,差别均具有显著性。与VD3中剂量组相比,VD3中剂量+二甲双胍中剂量联合用药组小鼠结肠组织p-AMPK 蛋白表达均明显升高,p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6P 和 cyclinD1蛋白表达水平明显降低,差别均具有显著性。与二甲双胍中剂量组相比,VD3中剂量+二甲双胍中剂量联合用药组小鼠结肠组织p-AMPK蛋白表达均明显升高,cyclinD1蛋白表达水平明显降低,差别均具有显著性。结论:VD3和二甲双胍单独给药对DMH和DSS联合诱导的小鼠结肠炎相关结肠肿瘤形成抑制作用很弱且结果不稳定,但对结肠异常隐窝病灶有明显的抑制作用,但量效关系不明显。VD3和二甲双胍联合给药能使二药抑制DMH和DSS联合诱导的结肠炎相关异常隐窝病灶与结肠肿瘤发生的作用明显增强。其抗肿瘤机制可能与VD3协同二甲双胍激活小鼠结肠组织中p-AMPK蛋白表达,抑制p-mTOR蛋白的表达,增加血清IGFBP-3含量,抑制p-S6P和Cyclin D1蛋白的表达有关。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 二甲双胍的抗肿瘤作用
• 1.2 维生素D3的抗肿瘤作用
• 第二章 研究内容
• 2.1 主要药效学研究
• 2.1.1 大体观察指标
• 2.1.2 Aberrant crypt foci （ACF）检测
• 2.1.3 病理组织学观察指标
• 2.2 VD3增强二甲双胍预防炎症相关性结肠肿瘤形成的协同机理研究
• 2.2.1 对生长因子（胰岛素、IGF-1）受体及其相关调节因子表达的影响
• 2.2.2 对空腹血糖浓度的影响
• 2.2.3 对AKT活化的影响
• 2.2.4 对AMPK/mTOR/p70S6k/S6活化的影响
• 2.2.5 对细胞周期调控蛋白表达的影响
• 第三章 材料与方法
• 3.1 主要材料
• 3.2 主要设备
• 3.3 实验动物
• 3.4 实验分组
• 3.5 小鼠结肠肿瘤模型复制
• 3.6 给药
• 3.7 样品收集
• 3.8 Western blot
• 3.9 ELISA
• 3.10 统计学分析
• 第四章 实验结果
• 4.1 主要药效学
• 4.1.1 大体指标观察
• 4.1.2 对大肠肿瘤数目的影响
• 4.1.3 对肿瘤体积的影响
• 4.1.4 对ACF形成的影响
• 4.2 机理学研究
• 4.2.1 小鼠空腹血糖含量的变化
• 4.2.2 小鼠血清IGF-1含量的变化
• 4.2.3 小鼠血清Insulin含量的变化
• 4.2.4 小鼠血清IGFBP-1含量的变化
• 4.2.5 小鼠血清IGFBP-3含量的变化
• 4.2.6 小鼠结肠组织p-AMPK蛋白表达的变化
• 4.2.7 小鼠结肠组织p-AKT蛋白表达的变化
• 4.2.8 小鼠结肠组织p-mTOR蛋白表达的变
• 4.2.9 小鼠结肠组织p-P70S6K蛋白表达的变
• 4.2.10 小鼠结肠组织p-S6P蛋白表达的变化
• 4.2.11 小鼠结肠组织Cyclin D1蛋白表达的变化
• 第五章 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 缩写词表
• 在学期间研究成果
• 致谢