猪NNAT印记基因启动子的甲基化及其表达调控

论文摘要

印记基因在胎盘发育和功能中起着关键的调控作用,保证胎儿的正常生长与发育。印记基因的异常表达往往导致胎盘发育异常、表型缺陷等多种疾病,严重则导致胚胎死亡甚至癌症肿瘤发生。印记基因分为父系（父源）印记基因与母系（母源）印记基因。母系印记父系表达的基因常常促进细胞增殖、促进胎儿生长发育,以及促进胎盘对胎儿营养物质的输送。父系印记母系表达的基因往往抑制胎儿生长、抑制细胞分裂和组织肥大。本研究针对父系表达的印记基因NNAT（Neuronatin）进行相关表达机制以及调控方面的研究。通过生物信息学分析发现NNAT基因启动子的3个甲基岛,对克隆巨舌猪与正常猪之间,以及国外品种大白猪与国内品种二花脸猪之间印记基因NNAT的甲基化程度进行了研究,同时分析了NNAT的下游调控通路与糖转运相关通路基因的关系,并在大白猪与二花脸猪妊娠75天与90天胎盘中检测了NNAT的表达和糖转运通路相关基因的表达,以及在细胞水平上通过高表达NNAT检测下游糖转运蛋白GLUT的表达量,研究了该基因在不同猪种妊娠不同时期胎盘中所发挥的生物学作用,取得的主要结果如下：1)利用Pyrosequencing技术与荧光Real-Time PCR技术研究了核移植巨舌症猪、核移植正常猪和体外受精正常猪之间印记基因NNAT启动子2个甲基化岛的甲基化程度与表达水平的关系,发现在巨舌症猪中NNAT基因的表达差异与基因启动子甲基化水平相关,原本印记的母源染色体上等位基因启动子去甲基化导致了母源等位基因从沉默状态转为激活状态。同理,针对大白猪与二花脸猪妊娠75天与90天的胎盘检测了NNAT基因启动子2个甲基岛甲基化程度与表达水平关系,结果在正常猪品种间没有发现NNAT基因启动子甲基化程度的显著差异,在不同品种的正常猪种间NNAT基因表达变化并非由甲基化的改变所致。2)通过IPA软件以及文献报道构建了NNAT的下游调控通路,表明NNAT可能通过P13K信号通路对下游糖转运蛋白GLUT进行调控。3)组织水平上,利用荧光Real-Time PCR技检测了在二花脸与大白猪妊娠75天及90天胎盘中NNAT基因的表达量变化以及糖转运通路相关基因的表达,从结果中看出糖转运通路相关基因在大白猪中的表达高于二花脸,说明糖转运蛋白高表达与大白猪胎儿生长速度快、个体较大有关。此外,发现在大白猪妊娠90天胎盘中,NNAT基因高表达不直接上调糖转运通路基因的表达,而是存在更加复杂的调控机制以保证胎儿的正常发育。4)细胞水平上,通过构建pcDNA3.1-NNAT真核表达载体转染JEG3（人绒毛膜癌滋养层细胞）,发现过表达NNAT基因能上调GLUT1的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 研究问题的由来
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 胎盘简介
• 1.2.2 印记基因与胎盘发育
• 1.2.2.1 印记基因概述
• 1.2.2.2 印记基因的擦除与重建
• 1.2.2.3 印记基因的遗传分子机制
• 1.2.2.4 印记基因与癌症
• 1.2.2.5 印记基因对胎盘发育的影响
• 1.2.3 基因甲基化研究方法
• 1.2.3.1 全基因组甲基化扫描
• 1.2.3.2 单基因甲基化分析方法
• 1.2.3.3 焦磷酸测序原理
• 1.2.4 印记基因NNAT的研究进展
• 1.2.4.1 NNAT基因的结构
• 1.2.4.2 NNAT的功能研究
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 实验菌株和载体
• 2.1.3 主要试剂及其配置
• 2.1.3.1 主要试剂、耗材
• 2.1.3.2 主要试剂的配置
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.1.5 生物信息分析所需网站及数据库
• 2.1.5.1 分析所需软件
• 2.1.5.2 主要数据库及在线资源
• 2.2 研究的总体思路及研究方案图示
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 组织DNA提取方法
• 2.3.2 组织RNA提取方法
• 2.3.3 细胞提取RNA方法
• 2.3.4 RNA反转录
• 2.3.5 焦磷酸测序实验方法
• 2.3.5.1 重亚硫酸盐处理基因组DNA方法
• 2.3.5.2 PCR扩增NNAT基因启动子甲基岛
• 2.3.5.3 样品的预处理
• 2.3.5.4 焦磷酸测序检测NNAT基因启动子甲基化程度
• 2.3.6 pcDNA3.1-NNAT载体的构建
• 2.3.6.1 NNAT基因编码区扩增
• 2.3.6.2 DNA产物回收
• 2.3.6.3 目的片段与载体的连接
• 2.3.6.4 连接产物转化、测序
• 2.3.6.5 阳性克隆去内毒素质粒的提取
• 2.3.7 细胞培养及载体转染
• 2.3.8 荧光定量Real-Time PCR
• 2.3.8.1 引物设计合成
• 2.3.8.2 荧光定量Real-Time PCR方法
• 3 结果
• 3.1 NNAT基因的生物信息学分析
• 3.2 NNAT基因启动子甲基化与表达水平
• 3.2.1 甲基岛检测
• 3.2.2 BT、NT、IVF猪中NNAT基因启动子甲基化与表达分析结果
• 3.2.2.1 肝脏组织中NNAT基因启动子甲基化与表达
• 3.2.2.2 肌肉组织中NNAT基因启动子甲基化与表达
• 3.2.3 大白猪与二花脸猪中NNAT基因启动子甲基化与表达分析结果
• 3.2.3.1 大白猪与二花脸猪NNAT基因启动子甲基化
• 3.2.3.2 大白猪与二花脸猪NNAT基因表达差异
• 3.3 大白猪与二花脸猪NNAT基因与GLUT及其通路基因的关系
• 3.4 细胞水平上NNAT基因对GLUT基因表达的调控
• 3.4.1 pcDNA3.1-NNAT载体的构建
• 3.4.2 NNAT基因的高表达对GLUT基因的调控
• 4 讨论
• 4.1 实验结果的讨论
• 4.1.1 NNAT基因生物信息学分析的结果讨论
• 4.1.2 印记基因NNAT不同表达调控机制的结果讨论
• 4.1.2.1 BT、NT、IVF猪NNAT基因表达受启动子甲基化调控
• 4.1.2.2 大白猪与二花脸中NNAT基因表达不受启动子甲基化调控
• 4.1.2.3 总结印记基因NNAT表达调控机制
• 4.1.3 大白猪和二花脸猪胎盘中NNAT基因与糖转运通路相关基因的调控关系及其生物学功能
• 4.1.4 细胞水平NNAT基因对GLUT基因表达具有一定的调控作用
• 4.2 实验方法的讨论
• 4.2.1 焦磷酸测序方法讨论
• 4.2.2 定量方法的讨论
• 4.2.3 细胞转染方法的讨论
• 5 小结
• 5.1 本研究的主要结果与结论
• 5.2 本研究的创新点与特色
• 5.3 本研究的不足之处与下一步工作的建议
• 5.3.1 本研究的不足之处及其弥补
• 5.3.2 进一步深入工作的建议
• 参考文献
• 致谢