N-ras与epiregulin联合干扰对肝癌细胞增殖的抑制效果研究

论文摘要

肝癌发生和发展具有复杂的分子机制,有许多癌基因和信号传导通路参与其中,多靶点联合治疗可能为肝癌的治疗提供一种新的途径。RNA干扰可以实现多个靶点同时的特异性抑制,而且没有传统化学疗法带来的毒副作用,是一种有潜力的治疗手段。基于本研究室在N-ras干扰治疗肝癌研究的基础上,我们寻找到一个参与N-ras干扰后的补偿途径调控基因epiregulin。该基因与N-ras基因联合发挥协同效应,对epiregulin与N-ras进行双干扰,可以达到更好的治疗效果。一、瞬时及稳定干扰N-ras基因对肝癌细胞HepG2基因表达谱的影响1.RT-PCR法和Western blot法检测瞬时及稳定干扰后N-Ras RNA及蛋白水平的变化。结果显示瞬时和稳定干扰后,HepG2细胞中N-Ras的RNA以及蛋白水平相对于未处理以及mock处理组而言都有明显的降低。灰度扫描结果显示抑制率均约为60%。2.芯片实验检测瞬时及稳定干扰N-ras后变化的基因。与mock-siRNA处理组相比,N-ras-siRNA处理24小时后上调的基因为185个（ratio＞1.5）,下调的基因为206个（ratio＜0.67）;N-Ras-siRNA干扰48小时后上调的基因为291个,下调的基因为248个;与HepG2/mock细胞相比,N-Ras稳定干扰HepG2/N-ras（-）细胞上调的基因为482个,下调的基因的基因为524个。相对于瞬时干扰,稳定干扰后基因表达变化的幅度大。3.用DAVID生物信息学资源数据库进行基因功能富集分析。稳定干扰N-ras后的功能富集分析中出现了cell motility,actin filament-based process,acincytoskeleton organization and biogenesis等关键词。瞬时干扰N-ras 48小时后的功能富集分析中出现了regulation of epithelial cell proliferation,regulation of cellproliferation,cell adhesion等关键词。瞬时干扰N-ras 24小时后的功能富集分析中出现了cell cycle,regulation of progression through cell cycle,regulation of cell cycle等关键词。说明N-ras干扰后细胞周期、细胞增殖、细胞运动和细胞骨架等方面相关的基因发生了变化。4.用Pathway miner进行变化基因的通路分析。稳定干扰N-ras以及顺时干扰N-ras 48小时后,发生变化的通路相同,为focal adhesion,MAPK signaling pathway,regulation of actin cytoskeleton以及regulation of actin cytoskeleton,而瞬时干扰后24小时后变化的通路略有不同,依次为focal adhesion,cell cycle,MAPK signalingpathway以及wnt signaling pathway。5.Gene Cluster 3.0以及Java TreeView对六张芯片结果进行了聚类分析。与稳定干扰N-ras后的基因表达谱相比,瞬时干扰后的两组芯片的基因表达谱更为接近。变化趋势较为明显的ClusterⅠ-Ⅳ主要参与的细胞生物学过程依次为angiogensis和growth,Catalytic activity,Inflammatory response和cell adhesion以及Secretory pathway。6.用RT-PCR法验证三组芯片结果。稳定干扰N-ras变化的基因中我们验证的有HDGFRP3,GPNMB,VRK1,MKI67,TM4SF3,EREG以及ACTG2。N-ras干扰48小时组中我们挑选的基因为ACTC和FN1,N-ras瞬时干扰24小时组中我们挑选的基因为EREG,芯片结果和RT-PCR结果较为符合。7.观察N-ras干扰对HepG2细胞形态的影响。N-ras-siRNA干扰HepG2细胞后,细胞形态变得狭长,而mock-siRNA处理组的细胞形态没有明显的变化。二、筛选与N-ras联合干扰具有协同效果的基因1.RT-PCR法验证ACTG2-siRNAs的干扰效果后,用SRB法检测N-ras-siRNA与ACTG2-siRNA联合干扰对HepG2细胞增殖的影响。结果表明,浓度为100nM的ACTG2-siRNA1或N-ras-siRNA干扰后细胞的存活率分别为43.5%和66.5%。将浓度减半（各50nM）,联合干扰后细胞的存活率为67.5%,比抑制单基因略高,提高浓度（各100nM）后,联合干扰后细胞的存活率降为28%。ACTG2-siRNA2的情况与ACTG2-siRNA1大体相同。2.RT-PCR法验证EREG-siRNA的干扰效果后,用SRB法检测N-ras-siRNA与EREG-siRNA联合干扰对HepG2细胞增殖的影响。结果表明,浓度为100nM的EREG-siRNA1或N-ras-siRNA干扰后的细胞存活率分别为49%和41%。将浓度减半（各50nM）,联合干扰后细胞的存活率为36%,比抑制单基因有明显降低,提高浓度（各100nM）后,联合干扰后细胞的存活率降为15%。EREG-siRNA2的情况与EREG-siRNA1大体相同。进一步用SRB法检测epiregulin受体EGFR的小分子抑制剂AG1478对N-ras干扰的细胞增殖抑制增效作用。结果表明与对照组和mock-siRNA干扰组相比,N-ras干扰组对AG1478更加敏感。3.RT-PCR法验证R-ras-siRNAs的干扰效果后,用SRB法检测N-ras-siRNA与R-ras-siRNAs联合干扰对HepG2细胞增殖的影响。结果表明,浓度为100nM的R-ras-siRNA1或N-ras-siRNA干扰后细胞的存活率分别为43.5%和48%。将浓度减半（各50nM）,联合干扰后细胞的存活率为39.5%,比抑制单基因有明显降低,提高浓度（各100nM）后,细胞的存活率降为16%。4.RT-PCR法验证TM4SF1-siRNA的干扰效果后,用SRB法检测N-ras-siRNA与TM4SF1-siRNA联合干扰对HepG2细胞增殖的影响。结果表明,干扰N-ras或TM4SF1后细胞的存活率分别为43.5%和65%。将浓度减半（各50nM）,细胞的存活率为66.5%,提高浓度（各100nM）后,细胞的存活率降为28.5%。三、N-ras与epiregulin联合干扰效果以及机理探讨1.克隆形成实验检测N-ras与epiregulin联合干扰效果。结果表明N-ras-siRNA+EREG-siRNA1（各50nM）组与N-Ras-siRNA（100nM）以及EREG-siRNA1（100nM）组相比克隆形成数少量降低。N-Ras-siRNA+EREG-siRNA1（各100nM）与N-Ras-siRNA（100nM）以及EREG-siRNA1（100nM）组相比克隆形成数显著降低。此结果与N-ras与epiregulin联合干扰的SRB实验结果相符。2.流式细胞术检测N-ras以及epiregulin干扰对细胞周期分布的影响。结果表明,干扰N-ras与epiregulin均可增加G0/G1期细胞,降低S期细胞。与对照细胞相比,干扰N-ras或epiregulin使G0/G1期细胞分别增加了14.7%和11.9%。联合干扰N-ras和epiregulin使G0/G1期细胞增加到20.4%。结果证明单干扰N-ras或epiregulin均可造成一定的G0/G1期阻滞,而联合干扰会增强这种效应。3.Western blot检测N-ras以及epiregulin联合干扰对MAPK以及PI3K-Akt通路蛋白的影响。实验表明,干扰N-ras或epiregulin均可使ERK1/2和Akt的磷酸化水平降低,而总ERK1/2及Akt蛋白水平保持不变。干扰N-ras或epiregulin也可使c-myc蛋白表达降低。联合干扰N-ras和epiregulin会增强上述效应。4.Western blot检测N-ras以及epiregulin联合干扰对G1期蛋白的影响。实验结果表明,干扰N-ras或epiregulin均可降低Rb的磷酸化水平以及cyclin D1蛋白的表达水平,升高p21的表达水平。联合干扰N-ras和epiregulin会增强上述效应。这个结果支持了第2部分的实验结果,并进一步证明联合干扰N-ras和epiregulin可以通过对G0/G1期的阻滞来发挥作用。综上所述,基因芯片结果表明,N-ras干扰可对HepG2细胞的增殖、细胞周期、细胞粘附以及细胞骨架相关基因和通路产生影响。联合干扰N-ras和epiregulin对HepG2细胞增殖有协同抑制作用。Epiregulin可作为肝癌联合治疗的新靶点,联合干扰N-ras与epiregulin可作为治疗肝细胞癌的新方法。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 前言
• 实验材料与实验方法
• 实验材料
• 实验仪器
• 实验方法
• 实验结果
• 第一部分:瞬时及稳定干扰N-ras基因对肝癌细胞HepG2基因表达谱的影响
• 第二部分:筛选与N-ras联合干扰具有协同效果的基因
• 第三部分:N-ras与epiregulin联合干扰效果以及机理探讨
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢