水稻纹枯病菌遗传多样性及侵染水稻早期上调表达基因的分析

论文摘要

稻纹枯病严重制约水稻的产量和品质,已成为水稻上的首要病害。本论文以分离自我国湖北省、江西省、湖南省、江苏省、广西省等省份的纹枯病菌菌株为材料,研究了其遗传多样性;并以分离自武汉水稻田中的WH-1菌株为材料,分离获得了纹枯菌在侵染水稻早期上调表达的基因。主要结果如下:自水稻叶鞘发病部位及纹枯病菌核共分离获得1088株菌株,结合形态学和分子生物学等鉴定方法,确认98.2%的菌株为茄丝核菌AG-1ⅠA（Rhizoctonia solaniAG-1ⅠA）,另外有19株菌株为稻角担菌（Ceratobasidum oryzae-sativae）,1株菌株为茄丝核菌AG-7,表明引发水稻纹枯病的病菌主要为茄丝核菌AG-1融合群中的ⅠA亚群,有性态为担子菌门瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）。对来自同一田块或来自不同省份的菌株进行了比较,发现它们在生长、菌丝直径、菌落形态和致病力等方面存在丰富的多样性。随机引物扩增多态性分析（RAPD）表明来自同一水稻田块的菌株间出现丰富的遗传分化现象,在0.83相似水平上,可以归于16个亚组;RAPD分析也表明来不同省份的71个菌株可以分为15个亚组,且与菌株来源没有显著关系。自广西桂林和湖北武汉的稻田中分别获得3株和1株表型特异的菌株,它们在生长、菌落形态和致病等方面与正常菌株均有显著性差异。对分离自广西桂林的菌株GXE4进行了详细的研究。与正常菌株相比,菌株GXE4菌落颜色深,呈黄褐色,菌丝生长速率慢,产菌核数量少且不易产生菌核,对水稻没有致病力。采用真菌rDNA基因ITS区域序列、核型观察、菌丝融合试验,证实菌株GXE4是茄丝核菌AG-1融合群ⅠA亚群。菌株GXE4中存在一条独立于染色体和线粒体DNA外的DNA片段,大小约3.6 kb,命名为3.6-kb frags。3.6-kbfrags可以稳定的存在于菌株内,不能被抗生素、原生质体再生、SDS和溴化乙锭等操作消除掉。DNaseI、RNase、限制性内切酶、外切酶Ⅲ等降解试验表明3.6-kb frags具双链DNA特性,且3’端不含有发夹结构或蛋白质保护性结构。对3.6-kb frags进行了克隆和序列分析,发现在3.6-kb frags至少包含有两个大小类似、序列具有同源性的遗传因子,分别命名为3.6-kb frag-1和3.6-kb frag-2;3.6-kb frag-1没有氨基酸数超过110的阅读框,推定不具有编码功能;不完全序列分析表明3.6-kb frag-2也没有较大的阅读框。DNA杂交结果显示位于约23 kb和7.0 kb处还存在与3.6-kbfrags具明显杂交信号的DNA片段。根据这些研究结果初步推定3.6-kb frags可能是dsDNA病毒基因组的缺陷型DNA,或线性真菌质粒。菌株RCOL-1分离自湖北武汉华中农业大学试验田。菌株RCOL-1对水稻没有致病力,它与双核菌稻角担菌（C.oryzae-sativa）在生长、菌落形态、菌核大小等表型上非常相似,与茄丝核菌AG-1融合群的菌株则有显著的差异。DAPI荧光染色核型分析表明,菌株RCOL-1的细胞核型没有规律,约95.9%为双核,2.8%为多核,1.3%为单核。通过特异性引物PCR扩增及DNA杂交证实RCOL-1中含有C.oryzae-sativae和T.cucumeris两种真菌的rDNA;进一步研究发现该菌株中存在4种类型的核糖体RNA的内转录间隔区（ITS,internal transcribed space）,其中大部分的ITS序列与C.oryzae-sativae的相同,少部分的ITS与T.cucumeris相同;另有2种ITS是这两种真菌ITS的嵌合物,即ITS1与C.oryzae-sativae的ITS1相同,ITS2与T.cucumeris的ITS2相同,或ITS1与T.cucumeris的ITS1相同,ITS2与C.oryzae-sativae的ITS2相同。推定RCOL-1中存在4种类型的ITS是T.cucumeris中的rRNA基因向C.oryzae-sativae水平转移的结果。以水稻纹枯病菌菌株WH-1和水稻9311为材料,采用抑制差减杂交（suppressionsubtractive hybridization,SSH）的方法,筛选获得了129个病菌侵染水稻初期（12 hpi）表达量明显增强的EST克隆。对表达量明显增强的克隆进行序列分析,结果发现96个克隆的序列与Genbank的序列具有一定程度的相似性,33个序列在数据库中没有相似性序列存在。对克隆了进行MIPS基因功能分类分析,推定这些上调表达基因的功能广泛,涉及到代谢（13%）、蛋白命运（9%）、信号传导（5%）、细胞防御（2%）等11类。其中包括了参与稻瘟病菌（M.grisea）、黑粉菌（U.maydis）等真菌致病过程的促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）、Cyclophilin、cyclin-dependent kinase等基因,它们也有可能参与纹枯病菌致病过程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 水稻纹枯病及其防治问题
• 2 水稻纹枯病菌群体遗传多样性研究进展
• 2.1 水稻纹枯病菌遗传多样性特性
• 2.2 水稻纹枯病菌遗传多样性研究
• 3 独立于染色体外的遗传因子研究进展
• 3.1 真菌病毒研究进展
• 3.1.1 真菌病毒核酸类型
• 3.1.2 茄丝核菌中真菌病毒的研究进展
• 3.2 丝状真菌质粒的研究进展
• 3.2.1 真菌质粒
• 3.2.2 茄丝核菌中真菌质粒的研究进展
• 4 基因水平转移研究进展
• 4.1 基因水平转移
• 4.1.1 HGT发生的范围
• 4.1.2 HGT的检测方法
• 4.1.3 基因发生HGT事件的条件
• 4.1.4 HGT对传统的生物进化系统发育树的影响
• 4.2 在真菌中发生HGT事件
• 4.2.1 移动DNA遗传因子发生HGT事件
• 4.2.2 真菌中发生HGT的证据
• 4.2.3 HGT事件对植物病原菌的影响
• 4.3 水稻上的两种病原真菌
• 4.4 核糖体基因（rDNA）
• 5 水稻纹枯病菌致病机理的研究进展
• 5.1 水稻纹枯病菌致病机理的研究
• 5.2 病原菌致病相关基因的研究方法
• 5.3 抑制差减杂交法在植物病理学上的应用
• 6 本研究的目的和意义
• 第二章 水稻纹枯病菌遗传多样性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 水稻纹枯病样品收集
• 1.1.2 供试水稻品种
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 水稻纹枯病菌菌株分离
• 1.2.2 水稻纹枯病菌菌丝生长速率测定
• 1.2.3 水稻纹枯病菌致病力测定
• 1.2.4 水稻纹枯病菌菌丝直径测定
• 1.2.5 水稻纹枯病菌核型观察
• 1.2.6 供试水稻纹枯病菌菌株的RAPD分析
• 1.2.7 供试水稻纹枯病菌菌株RAPD聚类分析
• 2 结果与分析
• 2.1 水稻纹枯病菌的分离概述
• 2.2 水稻纹枯病菌菌株生长速率分析
• 2.3 水稻纹枯病菌菌株致病力分析
• 2.4 同一田块的水稻纹枯病菌菌株部分生物学特性分析
• 2.5 不省份稻区的纹枯病菌菌株部分生物学特性分析
• 2.6 RAPD随机引物筛选结果
• 2.7 来自同一田块的水稻纹枯病菌遗传多样性分析
• 2.8 来自不同省份稻区的水稻纹枯病菌遗传多样性分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 3.2.1 水稻纹枯病菌多样性分析
• 3.2.2 水稻纹枯病菌遗传多样性丰富的原因
• 第三章:水稻纹枯病菌菌株GXE4及所含独立于染色体外的3.6-KBFRAGS基本特性的分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试真菌菌株及培养方法
• 1.1.2 细菌菌株及培养方法
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌株GXE4生物学特性
• 1.2.2 菌株GXE4的鉴定
• 1.2.3 菌株GXE4基因组DNA电泳分析
• 1.2.4 菌株GXE4中3.6-kb frags的稳定性
• 1.2.5 菌株GXE4中3.6-kb frags核苷酸属性分析
• 1.2.6 菌株GXE4中3.6-kb frags的克隆
• 1.2.7 菌株GXE4中3.6-kb frags Southern杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株GXE4生物学特性
• 2.1.1 菌株GXE4菌落形成过程的观察
• 2.1.2 菌株GXE4的生物学特性分析
• 2.1.3 菌株GXE4致病力测定
• 2.2 菌株GXE4的鉴定结果
• 2.2.1 菌株GXE4核型分析
• 2.2.2 菌株GXE4菌丝融合分析
• 2.2.3 菌株GXE4分子鉴定
• 2.3 菌株GXE4基因组总DNA电泳分析
• 2.4 独立于染色体外的3.6-kb frags稳定性分析
• 2.5 原生质体再生对菌株GXE4的菌落形态及3.6-kb frags的影响
• 2.6 溴化乙啶（EB）及SDS对菌株GXE4中3.6-kb frags的影响
• 2.7 菌株GXE4中3.6-kb frags的特性
• 2.8 水稻纹枯病菌菌株GXE4中3.6-kb frags的克隆及序列分析
• 2.9 3.6-kb frags的Southern杂交
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 3.2.1 引起病原真菌菌株毒力衰退的因素
• 3.2.2 水稻纹枯病菌GXE4中3.6-kb frags的特性
• 第四章 水稻纹枯病菌菌株RCOL-1遗传特征性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株及培养方法
• 1.1.2 细菌菌株及培养方法
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 菌株RCOL-1生物学特性
• 1.2.2 菌株RCOL-1核型观察
• 1.2.3 菌株RCOL-1基因组DNA的提取
• 1.2.4 菌株RCOL-1核糖体基因ITS区域扩增
• 1.2.5 PCR扩增产物DNA测序及序列分析
• 1.2.6 Southern杂交验证
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株RCOL-1生物学特性分析
• 2.1.1 菌株的菌落形态比较分析
• 2.1.2 菌株RCOL-1扩展速度分析
• 2.2 菌株RCOL-1核型分析
• 2.3 菌株RCOL-1分子鉴定
• 2.4 菌株RCOL-1中核糖体基因Southern杂交
• 2.5 菌株RCOL.1中含有的四种类型rDNA基因ITS序列验证
• 2.6 菌株RCOL-1中四种类型rDNA基因ITS所占比例分析
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 3.2.1 菌株RCOL-1中出现异常核糖体基因ITS序列的可能原因
• 3.2.2 瓜亡革菌和角担菌间发生HGT事件的可能性
• 3.2.3 核糖体基因发生HGT事件的意义
• 第五章 水稻纹枯病菌侵染水稻早期上调裹达基因的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 水稻纹枯病菌的侵染观察
• 1.2.2 水稻纹枯病菌总RNA的提取与mRNA的分离
• 1.2.3 水稻纹枯病菌致病相关基因SSH cDNA文库的构建
• 1.2.4 SSH cDNA文库插入片段大小的检测
• 1.2.5 反向Northern杂交验证
• 1.2.6 测序及生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 水稻纹枯病菌菌株WH-1侵染水稻叶片的过程
• 2.2 差减文库的构建
• 2.2.1 差减杂交产物的选择性PCR扩增结果
• 2.2.2 差减杂交文库中克隆插入片段的大小
• 2.3 反向Northern杂交筛选差异表达克隆
• 2.4 差异克隆测序及同源性分析结果
• 2.5 功能分类
• 3 结论与讨论
• 3.1 结论
• 3.2 讨论
• 3.2.1 用于文库构建的材料的选取标准
• 3.2.2 SSH筛选的致病相关基因分析
• 第六章 全文总结和研究展望
• 1 全文总结
• 2 研究展望
• 2.1 水稻纹枯病菌遗传多样性研究展望
• 2.2 3.6-kb frags遗传特性研究展望
• 2.3 菌株RCOL-1遗传特性研究展望
• 2.4 纹枯病菌侵染水稻早期表达基因分析研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录