紫杉二烯合成酶及肿瘤血管生成抑制因子基因克隆与转基因研究

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的第二大杀手,寻找对肿瘤细胞具有高杀伤力而对正常细胞毒副作用小的新型抗肿瘤药物,具有非常重要的现实意义。本研究的目的旨在利用赤霉菌中存在的二萜类化合物赤霉素的代谢途径构建能够表达生产紫杉醇前体的重组赤霉菌,为20世纪人类发现的最重要的新型抗癌药物二萜类化合物紫杉醇开辟新的药源途径,为缓解药源短缺对紫杉醇应用范围进一步扩大造成的严重限制提供理论和技术依据;另一方面,为新一代抗肿瘤活性分子肿瘤血管生成抑制因子Arresten寻找安全、有效、廉价、易于推广应用的蛋白表达生产系统。 Ⅰ 采用RT-PCR方法从红豆杉胚性愈伤组织细胞系E3B中克隆紫杉二烯合成酶基因全长cDNA。将可以在大肠杆菌BL21s中表达、序列正确的紫杉二烯合成酶基因全长cDNA引入表达载体pAN52-1Not的起始密码子ATG下游,并将选择标记潮霉素B抗性表达框引入pAN52-1Not完整转录单位的侧翼区域,获得紫杉二烯合成酶基因cDNA表达载体pANts-hyg。 Ⅱ 采用PCR扩增法从赤霉菌基因组中克隆了赤霉素生物合成途径中第一个特异性关键酶——内根-贝壳杉烯合成酶基因cps的部分序列作为同源片断,以平端连接的方式引入丝状真菌表达载体pCSN44的HindⅢ位点,获得旨在中断赤霉素生物合成途径的cps基因打靶载体pCSNcps。 Ⅲ 通过单因素实验建立了本实验用赤霉菌菌株原生质体制备方法。研究结果表明,以10ml含15%粗制崩溃酶的酶解体系于37℃酶解4h,6个实验用赤霉菌受试菌株的原生质体产量都可以达到106/mL,能够满足遗传转化操作的需要,而使用溶壁酶制备实验用赤霉菌菌株原生质体的产量不足103/mL。 Ⅳ 建立了适用于赤霉菌菌株CBS195.34的原生质体/PEG法转化体系,通过原生质体/PEG转化法获得少量赤霉菌转化子。经过PCR检测及Southern blot杂交检测,证实本研究采用原生质体/PEG法以pANts-hyg转化获得一株基因组整合有紫杉二烯合成酶基因cDNA的赤霉菌转化子和4株pCSNcps转化、潮霉素B抗性水平高于亲本菌株的赤霉菌转化子。整合有外源基因的赤霉菌转化子的生长形态和生长能力与亲本菌株相比存在显著差异。而且,随着传代次数的增加,

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 目录
• 第一部分 紫杉二烯合成酶基因克隆及其转化赤霉菌的研究
• 1 文献综述
• 1.1 紫杉醇的发现及其抗癌作用机理的研究
• 1.1.1 紫杉醇的发现
• 1.1.2 紫杉醇的抗癌作用机理
• 1.1.3 紫杉醇的临床应用
• 1.2 紫杉醇工业生产与药源供给现状
• 1.2.1 从栽培品种中提取紫杉醇
• 1.2.2 从红豆杉近缘科属植物中筛选含紫杉醇的植物
• 1.2.3 化学全合成紫杉醇
• 1.2.4 生物/化学半合成生产紫杉醇
• 1.2.5 红豆杉内生真菌发酵
• 1.2.6 利用植物细胞培养技术生产紫杉醇
• 1.3 紫杉醇生物合成的研究
• 1.3.1 紫杉醇的生物合成途径
• 1.3.2 参与紫杉醇生物合成的代谢酶类
• 1.4 本实验研究背景、目的及意义
• 1.4.1 目的基因的选择依据
• 1.4.2 以赤霉菌作为目的基因表达受体的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 紫杉二烯合成酶基因全长cDNA克隆
• 2.3.3 ts-cDNA丝状真菌表达载体构建
• 2.3.4 cps基因片断克隆及cps基因打靶载体构建
• 2.3.5 赤霉菌原生质体制备
• 2.3.6 赤霉菌转化
• 2.3.7 赤霉菌转化子的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 紫杉二烯合成酶基因cDNA克隆
• 3.1.1 红豆杉愈伤组织细胞系总RNA RT-PCR结果
• 3.1.2 紫杉二烯合成酶cDNA在大肠杆菌BL21s中的表达
• 3.1.3 ts-cDNA与pET15b重组质粒的酶切检测
• 3.1.4 ts-cDNA序列测定
• 3.2 ts-cDNA丝状真菌表达载体构建
• 3.2.1 ts-cDNA与pAN52-1Not重组
• 3.2.2 pANts5与潮霉素B抗性表达框重组
• 3.3 cps基因片断克隆及cps基因打靶载体构建
• 3.3.1 赤霉菌菌株赤霉素的合成
• 3.3.2 赤霉菌基因组DNA提取及cps基因片断的克隆化
• 3.3.3 cps基因打靶载体构建
• 3.4 赤霉菌原生质体制备
• 3.4.1 破壁酶种类对赤霉菌原生质体产量的影响
• 3.4.2 pH值对赤霉菌原生质体产量的影响
• 3.4.3 酶解温度对赤霉菌原生质体产量的影响
• 3.4.4 破壁酶浓度对赤霉菌原生质体产量的影响
• 3.4.5 酶解时间对赤霉菌原生质体产量及再生率的影响
• 3.4.6 菌龄对赤霉菌原生质体产量及再生率的影响
• 3.4.7 再生培养基对赤霉菌原生质体再生率的影响
• 3.4.8 赤霉菌原生质体再生观察
• 3.5 赤霉菌转化
• 3.5.1 赤霉菌菌株潮霉素敏感性测定
• 3.5.2 电穿孔法转化赤霉菌原生质体
• 3.5.3 基因枪法转化赤霉菌菌丝断片
• 3.5.4 原生质体/PEG法转化赤霉菌
• 3.6 赤霉菌转化子的鉴定
• 3.6.1 赤霉菌转化子的形态鉴定
• 3.6.2 赤霉菌转化子的分子生物学鉴定
• 4 讨论
• 4.1 紫杉醇的药源开发
• 4.2 基因克隆材料的选择
• 4.3 赤霉菌菌种差异对转化效率的影响
• 4.4 赤霉菌低转化效率的形成因素
• 4.5 转化方法对转化效率的影响
• 5 结论
• 6 本研究创新点
• 7 本研究有待进一步开展的工作
• 第二部分 肿瘤血管生成抑制因子Arresten基因克隆及其对烟草的转化
• 1 抗肿瘤药物的研究现状
• 1.1 正在研发的新型抗肿瘤药物
• 1.2 肿瘤新生血管生成抑制剂
• 1.2.1 血管生成抑制理论的提出
• 1.2.2 肿瘤血管生成抑制剂的研发概况
• 1.3 本研究的目的意义
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株、质粒和材料
• 2.2 试剂
• 2.3 方法
• 2.3.1 Arresten基因全长cDNA克隆
• 2.3.1.1 RT-PCR法扩增Arresten基因全长cDNA
• 2.3.1.2 arresten-cDNA在pMD18-T vector中的克隆化
• 2.3.2 arresten-cDNA植物表达载体构建
• 2.3.2.1 arresten-cDNA回收及其与pCAMBIA1301的重组
• 2.3.2.2 pCAMBIAarr转化根癌农杆菌LBA4404
• 2.3.3 烟草一步成苗再生体系的建立
• 2.3.3.1 烟草无菌苗的培养
• 2.3.3.2 秦烟95叶片外植体不定芽的诱导
• 2.3.3.3 秦烟95对潮霉素B的敏感性测定
• 2.3.4 根癌农杆菌LBA4404（pCAMBIAarr）转化烟草秦烟95
• 2.3.4.1 根癌农杆菌LBA4404（pCAMBIAarr）的培养
• 2.3.4.2 农杆菌感染
• 2.3.4.3 烟草转化材料的培养及筛选
• 2.3.4.4 烟草转基因苗的培养
• 2.3.4.5 烟草转基因苗的炼苗移栽
• 2.3.5 转基因烟草的鉴定
• 2.3.5.1 烟草基因组DNA的提取
• 2.3.5.2 转基因烟草的PCR检测
• 2.3.5.3 转基因烟草的Southern杂交检测
• 2.3.5.4 转基因烟草的RT-PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 全长arresten-cDNA克隆
• 3.1.1 人胎盘组织总RNA提取
• 3.1.2 RT-PCR法克隆arresten-cDNA
• 3.1.3 arresten-cDNA在T-vector中的克隆化
• 3.1.4 arresten-cDNA序列测定
• 3.2 arresten-cDNA植物表达载体构建
• 3.2.1 arrseten-cDNA植物表达载体构建流程
• 3.2.2 arrseten-cDNA与pCAMBIA1301重组质粒鉴定
• 3.3 pCAMBIAarr转化根癌农杆菌LBA4404
• 3.4 烟草一步成苗再生体系的建立
• 3.4.1 烟草无菌苗培养及叶片诱导再生植株
• 3.4.2 秦烟95对潮霉素B的敏感性
• 3.5 根癌农杆菌LBA4404（pCAMBIAarr）转化烟草秦烟95
• 3.5.1 转化子的筛选与植株再生
• 3.5.2 浸染时间对转化效率的影响
• 3.5.3 烟草转基因苗的培养与移栽
• 3.6 烟草转基因苗的检测
• 3.6.1 PCR法检测转基因烟草中目的基因的整合
• 3.6.2 Southen blot杂交检测转基因植株
• 3.6.3 RT-PCR检测转基因植株中目的基因转录水平上的表达
• 4 讨论
• 4.1 关于Arresten表达受体的选择
• 4.2 利用转基因植物生产药用蛋白的可操作性
• 4.3 烟草作为药用蛋白表达受体的优越性
• 4.4 烟草作为药用蛋白生产系统亟待解决的问题
• 5 结论
• 6 本研究创新点
• 7 本研究有待进一步开展的工作
• 参考文献
• 攻读博士学位期间研究成果和奖励
• 致谢