腺病毒介导的RPL23基因转染通过对MDM2-p53反馈环的调节抑制p53野生型胃癌细胞的生长

腺病毒介导的RPL23基因转染通过对MDM2-p53反馈环的调节抑制p53野生型胃癌细胞的生长

论文摘要

p53的失活是肿瘤转化过程中最常见的事件之一。人类大部分肿瘤的发生和发展同p53的变异和缺失密切相关。p53在人类肿瘤中突变率很高,平均达到50%;尽管如此,仍有约50%的肿瘤表达野生型p53(wt-p53),其中多数因细胞内降解代谢或下游信号通路的改变而致p53正常功能缺失。MDM2在调节p53浓度及活性中起关键作用。在正常细胞中,MDM2通过对p53蛋白持续而又快速的降解使p53活性保持在一个适当的水平,这是生物体维持正常生长的一种平衡调控手段。MDM2本身是p53的转录靶基因,因而两者构成负反馈环路,调节p53的稳定性。但在一些细胞中,由于基因扩增或其它原因导致MDM2水平的升高,从而导致对p53产生构成性的、非正常的抑制作用,并且不可逆地促使其降解,使p53对细胞正常的调控平衡被破坏,造成细胞生长失控,因而变得具有肿瘤细胞的特性。将p53从被MDM2的抑制中释放出来或阻断MDM2与其它基础转录因子的相互作用以恢复p53的正常功能,即可抑制癌的发生或发展。已有的研究显示,核糖体蛋白L23(RPL23)是细胞内调节MDM2-p53反馈环的一个重要分子。通过与MDM2的直接结合,RPL23抑制MDM2对p53的泛素化和降解而间接促使wt-p53功能的活化,进而诱导p53依赖的细胞周期阻滞和/或凋亡。此外,研究显示外源性表达的RPL23在胞核和胞浆内均可与MDM2结合,提示RPL23蛋白可以复合物的形式将MDM2阻滞于胞核或胞浆,进而间接抑制MDM2与p53的结合及对p53的泛素化和降解。基于此,我们设想以RPL23基因为靶点的肿瘤基因治疗是一可行策略。目的:探讨腺病毒介导的RPL23基因转染是否可通过对MDM2-p53相互作用的抑制诱导胃癌细胞内源性wt-p53蛋白的积聚活化并进而抑制其生长。方法:1、利用免疫组织化学染色的方法观察p53和MDM2在胃癌组织中的表达情况;2、构建rAd5-RPL23重组腺病毒,并利用Western Blot、免疫沉淀及免疫荧光染色等方法鉴定其对胃癌细胞MDM2-p53反馈环的调节;3、应用Ad-RPL23重组腺病毒转染wt-p53型胃癌细胞系AGS和MKN45,观察其对胃癌细胞周期和/或凋亡的影响,并进行裸鼠体内成瘤实验,进一步验证Ad-RPL23重组腺病毒对p53野生型胃癌的生长抑制作用。结果:1、p53和MDM2在胃癌组织中的表达及意义我们利用免疫组化染色检测了p53和MDM2在94例胃癌原发灶中的表达。结果显示:p53(突变型)的检出率为36%(34/94),此外,在这些可以检出突变型p53蛋白表达的胃癌原发灶中并非所有癌细胞均是p53阳性表达,其阳性率差异比较大,从10%-99%,均数约30%,提示在胃癌原发灶中有更多的癌细胞为p53野生型;在62.8%(59/94)的胃癌原发灶中可以检测到MDM2表达,定位于胞浆和胞核,并且呈异质性表达;在我们的研究中亦发现胃癌淋巴结转移灶MDM2表达阳性率显著高于原发灶,提示MDM2的水平增高可能与胃癌细胞的转移密切相关。2、Ad-RPL23重组腺病毒的构建及其对MDM2-p53反馈环的调节本研究首先利用武汉晶赛公司Adenovirus Expression System重组腺病毒构建系统成功构建了rAd5-RPL23(Ad-RPL23),随后利用Western Blot、免疫共沉淀和免疫荧光等方法证实在胃癌细胞系MKN45中外源性RPL23蛋白可与内源性MDM2蛋白相互结合并抑制其E3泛素酶活性,进而诱导wt-p53蛋白的积聚活化。进一步实验,我们证实Ad-RPL23诱导的p53活化源于其对MDM2降解p53过程的抑制。3、Ad-RPL23转染对胃癌细胞细胞周期和/或凋亡的影响Ad-RPL23转染后,p53野生型人胃癌细胞系MKN45和AGS出现G1-S期阻滞,Western Blot结果显示,Ad-RPL23转染的MKN45和AGS细胞p53蛋白表达水平与MDM2蛋白表达水平具有一致性,显示外源性RPL23表达可抑制MDM2-p53相互作用并引起p53积聚活化,进而诱导p21的表达。此外,在MKN45细胞中,Ad-RPL23转染可以诱导明显的细胞凋亡,Western Blot结果显示,作为p53转录的靶基因,Bax和PUMA,两个已知的凋亡相关分子,表达均明显上调。在p53突变型胃癌细胞系MGC803中,Ad-RPL23转染对细胞周期及凋亡未有影响,显示外源性的RPL23是通过p53途径发挥其抑癌效应的。裸鼠体内成瘤实验进一步证实了上述结果。总之,本实验提供的数据表明,在野生型p53的胃癌细胞系中,外源性RPL23对MDM2-p53相互作用的抑制可以诱导p53的积聚活化,并进而诱导相应的细胞周期阻滞和/或凋亡。结论:外源性RPL23诱导的p53积聚活化是一种胃癌治疗的新策略。

论文目录

  • 缩略语表
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 文献回顾
  • 基于MDM2-p53反馈环的肿瘤治疗研究进展
  • 核糖体蛋白的核糖体外功能
  • 正文
  • 第一部分:p53和MDM2在胃癌组织中的表达及意义
  • 第二部分:RPL23重组腺病毒的构建及其对胃癌细胞MDM2-p53反馈环的调节
  • 第三部分:Ad-RPL23转染对胃癌细胞的生长抑制作用
  • 全文小结
  • 参考文献
  • 个人简历和研究成果
  • 致谢
  • 相关论文文献

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