腺病毒介导的RPL23基因转染通过对MDM2-p53反馈环的调节抑制p53野生型胃癌细胞的生长

论文摘要

p53的失活是肿瘤转化过程中最常见的事件之一。人类大部分肿瘤的发生和发展同p53的变异和缺失密切相关。p53在人类肿瘤中突变率很高，平均达到50％；尽管如此，仍有约50％的肿瘤表达野生型p53（wt-p53），其中多数因细胞内降解代谢或下游信号通路的改变而致p53正常功能缺失。MDM2在调节p53浓度及活性中起关键作用。在正常细胞中，MDM2通过对p53蛋白持续而又快速的降解使p53活性保持在一个适当的水平，这是生物体维持正常生长的一种平衡调控手段。MDM2本身是p53的转录靶基因，因而两者构成负反馈环路，调节p53的稳定性。但在一些细胞中，由于基因扩增或其它原因导致MDM2水平的升高，从而导致对p53产生构成性的、非正常的抑制作用，并且不可逆地促使其降解，使p53对细胞正常的调控平衡被破坏，造成细胞生长失控，因而变得具有肿瘤细胞的特性。将p53从被MDM2的抑制中释放出来或阻断MDM2与其它基础转录因子的相互作用以恢复p53的正常功能，即可抑制癌的发生或发展。已有的研究显示，核糖体蛋白L23（RPL23）是细胞内调节MDM2-p53反馈环的一个重要分子。通过与MDM2的直接结合，RPL23抑制MDM2对p53的泛素化和降解而间接促使wt-p53功能的活化，进而诱导p53依赖的细胞周期阻滞和/或凋亡。此外，研究显示外源性表达的RPL23在胞核和胞浆内均可与MDM2结合，提示RPL23蛋白可以复合物的形式将MDM2阻滞于胞核或胞浆，进而间接抑制MDM2与p53的结合及对p53的泛素化和降解。基于此，我们设想以RPL23基因为靶点的肿瘤基因治疗是一可行策略。目的：探讨腺病毒介导的RPL23基因转染是否可通过对MDM2-p53相互作用的抑制诱导胃癌细胞内源性wt-p53蛋白的积聚活化并进而抑制其生长。方法：1、利用免疫组织化学染色的方法观察p53和MDM2在胃癌组织中的表达情况；2、构建rAd5-RPL23重组腺病毒，并利用Western Blot、免疫沉淀及免疫荧光染色等方法鉴定其对胃癌细胞MDM2-p53反馈环的调节；3、应用Ad-RPL23重组腺病毒转染wt-p53型胃癌细胞系AGS和MKN45，观察其对胃癌细胞周期和/或凋亡的影响，并进行裸鼠体内成瘤实验，进一步验证Ad-RPL23重组腺病毒对p53野生型胃癌的生长抑制作用。结果：1、p53和MDM2在胃癌组织中的表达及意义我们利用免疫组化染色检测了p53和MDM2在94例胃癌原发灶中的表达。结果显示：p53（突变型）的检出率为36％（34/94），此外，在这些可以检出突变型p53蛋白表达的胃癌原发灶中并非所有癌细胞均是p53阳性表达，其阳性率差异比较大，从10％-99％，均数约30％，提示在胃癌原发灶中有更多的癌细胞为p53野生型；在62．8％（59/94）的胃癌原发灶中可以检测到MDM2表达，定位于胞浆和胞核，并且呈异质性表达；在我们的研究中亦发现胃癌淋巴结转移灶MDM2表达阳性率显著高于原发灶，提示MDM2的水平增高可能与胃癌细胞的转移密切相关。2、Ad-RPL23重组腺病毒的构建及其对MDM2-p53反馈环的调节本研究首先利用武汉晶赛公司Adenovirus Expression System重组腺病毒构建系统成功构建了rAd5-RPL23（Ad-RPL23），随后利用Western Blot、免疫共沉淀和免疫荧光等方法证实在胃癌细胞系MKN45中外源性RPL23蛋白可与内源性MDM2蛋白相互结合并抑制其E3泛素酶活性，进而诱导wt-p53蛋白的积聚活化。进一步实验，我们证实Ad-RPL23诱导的p53活化源于其对MDM2降解p53过程的抑制。3、Ad-RPL23转染对胃癌细胞细胞周期和/或凋亡的影响Ad-RPL23转染后，p53野生型人胃癌细胞系MKN45和AGS出现G1-S期阻滞，Western Blot结果显示，Ad-RPL23转染的MKN45和AGS细胞p53蛋白表达水平与MDM2蛋白表达水平具有一致性，显示外源性RPL23表达可抑制MDM2-p53相互作用并引起p53积聚活化，进而诱导p21的表达。此外，在MKN45细胞中，Ad-RPL23转染可以诱导明显的细胞凋亡，Western Blot结果显示，作为p53转录的靶基因，Bax和PUMA，两个已知的凋亡相关分子，表达均明显上调。在p53突变型胃癌细胞系MGC803中，Ad-RPL23转染对细胞周期及凋亡未有影响，显示外源性的RPL23是通过p53途径发挥其抑癌效应的。裸鼠体内成瘤实验进一步证实了上述结果。总之，本实验提供的数据表明，在野生型p53的胃癌细胞系中，外源性RPL23对MDM2-p53相互作用的抑制可以诱导p53的积聚活化，并进而诱导相应的细胞周期阻滞和/或凋亡。结论：外源性RPL23诱导的p53积聚活化是一种胃癌治疗的新策略。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• 基于MDM2-p53反馈环的肿瘤治疗研究进展
• 核糖体蛋白的核糖体外功能
• 正文
• 第一部分:p53和MDM2在胃癌组织中的表达及意义
• 第二部分:RPL23重组腺病毒的构建及其对胃癌细胞MDM2-p53反馈环的调节
• 第三部分:Ad-RPL23转染对胃癌细胞的生长抑制作用
• 全文小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢