鲑鱼降钙素转基因定位整合的研究

论文摘要

转基因动物是通过遗传工程手段对动物基因组的结构或组成进行人为改造,并使改造后的基因组在世代间可以传递和表达的动物。随着生物技术的飞速发展,通过制备转基因动物来生产蛋白药物成为当前研究热点。鲑鱼降钙素是一种治疗骨质疏松症、骨痛等症状的有效药物,已在很多国家和地区都有着广泛的应用,但其产量尚不能满足需求。利用转基因技术获得转基因山羊,实现鲑鱼降钙素的乳腺特异表达,可大量产出鲑鱼降钙素,有着良好的成本效益和市场前景。本文通过转基因的随机整合和定位整合两条路径进行了乳腺特异表达鲑鱼降钙素转基因山羊的制备研究。在随机整合转基因山羊制备方面,本研究构建了牛p-乳球蛋白启动子调控表达的鲑鱼降钙素乳腺特异表达载体pBLG-sct。从pBLG-sct载体中切出线性化的鲑鱼降钙素表达框架与筛选标记基因Neo的筛选框架共转染羊胎儿成纤维细胞,600ug/ml的G418筛选14天获得克隆细胞127株,扩大培养至6孔板,有15株细胞用于检测,其中有11株整合。取2株细胞进行体细胞克隆,其中克隆细胞株sct-neo-8的核移植融合率达到91.04%（183/201）,移植受体17只,克隆细胞株sct-neo-9的核移植融合率达到88.43%（214/242）,移植受体23只。移植30天后,B超妊娠检查有11头受体山羊怀孕。至妊娠57天,有1只怀孕羊流产,流产胎儿整合检测表明为sct整合阳性。为了提高转基因的表达效率,对sct的乳腺特异表达框架进行了定位整合研究。首先验证了在山羊成纤维细胞内细胞穿透性Cre酶（TAT-Cre）介导标记基因的删除效率。通过IPTG诱导大肠杆菌BL-21表达TAT-cre酶,利用SP sepharoseTM柱纯化获得1.883mg/ml的TAT-cre酶。使用200μg/ml的TAT-cre处理共转染了loxp-neo-tk-loxp框架和BLG-sct的山羊胎儿成纤维细胞克隆,统计结果显示TAT-cre酶在山羊成纤维细胞内有良好活性,其介导标记基因的删除效率达到43.9%。最后,构建了框架为loxp-zeo-sct-loxp的载体p2xGsct-zeo,并将该环状载体电穿孔转染含有loxp-neo-tk-loxp框架的hLYZ转基因山羊胎儿成纤维细胞,通过TAT-cre酶处理,检测出有定位整合的特异性条带出现,说明TAT-cre介导体p2xGsct-Zeo置换hLYZ转基因山羊基因组中的loxp-neo-tk-loxp框架,以实现目的基因定位整合的试验方案是可行的。综上所述,本研究不仅获得了随机整合鲑鱼降钙素乳腺特异表达框架的转基因细胞及胎儿,而且初步证实了利用TAT-Cre可实现转基因过程中的标记基因删除和外源基因的定位整合,为获得高表达鲑鱼降钙素转基因山羊和实现转基因的定位整合奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文缩略词表
• 目录
• 第一章 背景与综述
• 1. 转基因动物研制技术进展
• 1.1 转基因动物的概述
• 1.2 转基因动物的研制方法
• 1.3 转基因动物的应用
• 2. 动物体内的转基因定位整合研究进展
• 3. 鲑鱼降钙素重组表达研究进展
• 3.1 降钙素蛋白及其基因
• 3.2 降钙素的药理作用
• 3.3 降钙素的制备
• 3.4 降钙素酰胺化
• 4. 研究思路
• 第二章 鲑鱼降钙素随机整合转基因山羊的研制
• 前言
• 1. 材料
• 1.1 菌种
• 1.2 质粒载体、引物及检测
• 1.3 主要试剂材料
• 1.4 主要仪器设备
• 2. 方法
• 2.1 鲑鱼降钙素基因合成
• 2.2 鲑鱼降钙素乳腺特异表达框架的构建
• 2.3 山羊胎儿成纤维细胞的分离和培养
• 2.4 电转化
• 2.5 整合细胞克隆的挑选与鉴定
• 2.6 卵母细胞制备与受体羊的同步
• 2.7 体细胞克隆用细胞株的准备
• 2.8 重构卵的制备与激活
• 2.9 重构卵的包埋、回收与发育胚胎的移植
• 2.10 流产胎儿的整合检测
• 3 结果
• 3.1 乳腺特异表达鲑鱼降钙素框架的构建
• 3.2 pBLG-sct整合细胞的获得
• 3.5 体细胞克隆
• 3.6 流产胎儿的整合检测
• 4. 讨论
• 第三章 TAT-CRE介导山羊成纤维细胞内标记基因的删除效率研究
• 前言
• 1. 材料
• 1.1 细胞
• 1.2 菌种
• 1.3 质粒载体、引物及检测
• 1.3 主要试剂材料
• 1.4 主要实验仪器
• 2. 方法
• 2.1 TAT-cre酶的表达纯化
• 2.2 纯化后的TAT-cre酶的SDS-PAGE电泳鉴定
• 2.3 TAT-cre酶的浓缩
• 2.4 TAT-cre酶浓度的测定
• 2.5 TAT-cre酶体内活性的检测
• 2.6 TAT-cre酶细胞内删除效率的检测
• 3. 结果
• 3.1 TAT-cre的纯化
• 3.2 TAT-cre酶的浓缩
• 3.3 TAT-cre酶浓度的测定
• 3.4 TAT-cre酶的体外活性检测
• 3.5 TAT-cre酶的细胞内删除活性检测
• 3.6 TAT-Cre酶对标记基因的删除效率检测
• 4. 讨论
• 第四章 鲑鱼降钙素乳腺特异表达载体的定位整合研究
• 前言
• 1. 材料
• 1.1 细胞
• 1.2 菌种
• 1.3 质粒载体、引物及检测
• 1.3 主要试剂材料
• 1.4 主要实验仪器
• 2. 方法
• 2.1 双loxp位点的人工合成
• 2.2 p2xGsct的构建
• 2.3 筛选基因Zeocin的扩增及Ta载体克隆
• 2.4 p2xGsct-zeo的构建
• 2.5 TAT-cre介导p2xGsct-zeo的脂质体转染溶菌酶转基因山羊的耳成纤维细胞
• 2.6 TAT-cre酶介导载体p2xGsct-zeo电传孔转染人溶菌酶转基因山羊胎儿成纤维细胞
• 3. 结果
• 3.1 p2xGsct-zeo的构建
• 3.2 脂质体转染溶菌酶转基因羊胎儿成纤维细胞
• 3.3 电穿孔转染溶菌酶转基因羊胎儿成纤维细胞
• 4. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 溶液配方