氟铃脲降解菌的分离鉴定、降解特性及降解氟铃脲的酰胺酶基因（amiH）的克隆和表达

论文摘要

氟铃脲是美国陶氏益农公司1987年开发生产的一种高效、广谱、低毒的苯甲酰脲类杀虫剂,几丁质合成抑制剂,通过抑制几丁质的合成杀死害虫。它是国家石化局和农业部制定的中国农药工业“十五”发展规划要求中的高毒有机磷农药的替代品种之一。被广泛用于蔬菜、棉花和果树的害虫防治,及真菌引起的植物病害。但是氟铃脲在作物上的不正确使用也会引起药害、对鱼类和家蚕毒性大。目前的研究主要集中在氟铃脲的药效、杀虫效果、农药残留与毒性,以及在土壤中的降解动态。对于分离到的纯种微生物对氟铃脲的降解鲜有报道,没有对其代谢途径与酶进行研究。从农药厂废水处理池的活性污泥中分离到1株能降解氟铃脲的菌株,命名为FLN-7, GenBank序列号为（EU725799）。根据表型特征、生理生化特性及16S rRNA序列同源性分析,将FLN-7归类为副球菌属（Paracoccus sp.）,研究结果表明该菌能在含氟铃脲（50 mg·L-1）的基础盐液体培养基中降解氟铃脲,7d降解率达89%。研究了它的生长特性、对氟铃脲的降解特性。通过高效液相色谱与质谱推断出氟铃脲在Paracoccus sp. FLN-7体内代谢过程的起始反应是断裂其结构核心的一个酰胺键。通过构建基因组DNA文库,成功地从氟铃脲降解菌株Paracoccus sp. FLN-7中克隆到一个酰胺酶基因,命名为amiH。该基因含1395个碱基,编码465个氨基酸,G+C mol%含量为67.81%,通过Omiga分析AmiH是分子量为49.6kD,等电点（pI）为5.3的酶。以pET29a为载体,构建表达质粒pET29a-amiH,实现了AmiH蛋白在E. coli BL21（DE3）中的融合表达。降解实验表明AmiH能够降解氟铃脲、敌稗、乐果、氯苯胺灵、甲酰胺、乙酰胺、丙酰胺、丙烯酰胺、苯甲酰胺和尿素多种酰胺类化合物。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 文献综述
• 1 农药污染的微生物修复
• 1.1 生物修复
• 1.2 生物修复的分类
• 2 农药残留的微生物降解与降解农药的微生物种群
• 3 含氟农药的特点
• 4 苯甲酰脲类杀虫剂的作用机理
• 5 氟铃脲的的性质与应用
• 5.1 氟铃脲致畸变研究
• 5.2 工业合成路线
• 5.3 微生物对苯甲酰脲类杀虫剂的降解作用
• 6 本研究的意义
• 参考文献
• 第一章 氟铃脲降解菌FLN-7的分离鉴定与生长特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、培养基与试剂
• 1.2 降解菌株的富集与分离
• 1.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
• 1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列的测定
• 1.5 降解菌株系统发育地位的确定
• 1.6 菌体生长量的测定
• 1.7 氟铃脲含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 污染土壤中氟铃脲降解菌株的分离
• 2.2 降解菌株FLN-7的菌落形态及生理生化特征
• 2.3 降解菌株FLN-7的鉴定结果
• 2.4 环境条件对降解菌株FLN-7生长的影响
• 2.5 降解菌株FLN-7对抗生素的耐受性
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第二章 氟铃脲降解菌FLN-7降解特性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基与试剂
• 1.2 菌体生长量的测定
• 1.3 菌株FLN-7对氟铃脲农药降解特性研究
• 2 结果与讨论
• 2.1 培养时间对菌株FLN-7降解氟铃脲的影响
• 2.2 农药起始浓度对菌株FLN-7降解氟铃脲的影响
• 2.3 pH值对菌株FLN-7降解氟铃脲的影响
• 2.4 外加营养物质对菌株FLN-7降解氟铃脲的影响
• 2.5 菌株FLN-7对氟铃脲的降解途径
• 2.6 菌株FLN-7的降解谱
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 水解氟铃脲的酰胺酶基因antiH的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 所用菌株和质粒
• 1.2 酶、试剂和培养基配方
• 1.3 鸟枪法构建基因文库示意图
• 1.4 高效感受态细胞的制备
• 1.5 总DNA提取
• 1.6 质粒DNA小量提取
• 1.7 总DNA部分酶切体系建立
• 1.8 凝胶电泳回收酶切片段
• 1.9 酶连体系
• 1.10 转化和基因文库的构建
• 1.11 基因序列分析
• 1.12 阳性克隆降解氟铃脲的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株FLN-7总DNA提取和Sau3AI酶切
• 2.2 阳性克隆的获得
• 2.3 阳性克隆测序和ORF分析
• 2.4 核酸序列分析
• 2.5 氨基酸序列分析
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第四章 酰胺酶AmiH在E.coli BL21（DE3）的表达
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和培养基
• 1.2 所用菌株和质粒
• 1.3 大肠杆菌感受态细胞制备
• 1.4 酰胺水解酶基因PCR扩增
• 1.5 表达载体的构建
• 1.6 酰胺酶表达菌株构建和诱导表达
• 1.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.8 AmiH对各种酰胺类化合物的降解作用
• 2 结果与方法
• 2.1 amiH的PCR扩增
• 2.2 AmiH在大肠杆菌中的表达
• 2.3 酰胺酶AmiH对各种酰胺类化合物的降解作用
• 3 本章小节
• 参考文献
• 创新点
• 全文总结
• 附录一 实验用培养基及分子生物学试剂
• 附录二 菌株FLN-7的16S rRNA基因序列
• 致谢