论文摘要
研究背景和目的胃癌是世界范围内第四位的恶性肿瘤,继肺癌之后占据全世界恶性肿瘤死亡率的第二位。淋巴结转移是导致胃癌治疗失败和患者死亡的主要原因,是胃癌最强烈的预后因素。大约60%的可切除胃癌在诊断之时已经发生了淋巴结转移,因此进展期胃癌总的五年生存率不足20%。然而,人们对于胃癌淋巴结转移的分子机制却知之甚少。研究发现淋巴结转移是一个多步骤的过程,而这个过程的第一步就是肿瘤细胞侵入淋巴管。胃癌组织中常见到淋巴管新生,这为肿瘤细胞侵入淋巴管提供了方便,胃癌细胞周围的淋巴管新生可能在淋巴结转移的过程中起重要作用。VEGF-C是已知的诱导淋巴管新生的生长因子,可以结合并活化淋巴管内皮细胞上的受体VEGFR-3而诱导淋巴管新生。VEGF-D是新发现的VEGF家族成员,与VEGF-C有23.3%的同源氨基酸序列,而且与VEGF-C共有VEGFR-2和VEGFR-3两个受体,然而其在体内的生理作用至今不明。尽管人类对于淋巴管新生及肿瘤淋巴转移的研究取得了可喜的进步,但是关于肿瘤淋巴转移机制仍有很多关键问题有待解决:（1）肿瘤中心区是否存在有功能的淋巴管?（2）使肿瘤转移机会增加的是淋巴管新生还是淋巴管扩张?还是二者同时起作用?（3）VEGFC、D的表达是引起淋巴管新生,即密度的增加,还是引起淋巴管扩张,即淋巴管管径的增大?还是二者均有?这又是否足以导致淋巴结转移的增加?（4）新生淋巴管是否为淋巴转移所必须,原有淋巴管（preexisting lymph vessel）在肿瘤转移中的作用如何?（5）如何准确的预测肿瘤的淋巴转移?本研究采用透射电镜和光镜观测胃癌组织中微淋巴管的形态学特征,采用反转录聚合酶链反应和免疫组织化学技术检测胃癌组织中VEGF-C/D的表达,并联合应用癌旁区LVI-IHC检测进行SLNB,旨在探讨VEGF-C/D、癌旁区淋巴管新生、淋巴管扩张、淋巴管侵犯以及原有淋巴管与胃癌淋巴结转移的关系,探讨胃癌淋巴转移机制,并以期发现能够准确预测胃癌淋巴结转移的敏感指标。方法1.采用透射电镜和光镜观测胃癌远癌正常区、癌旁区、中心区组织内淋巴管的分布和形态学特征,并分析淋巴管的密度、面积、周径、扩张度、淋巴管侵犯等形态学指标与胃癌淋巴结转移的关系。2.采用RT-PCR、IHC检测胃癌组织、远癌正常区胃黏膜内VEGF-C、D的表达,并分析VEGF-C、D的表达与胃癌淋巴管新生、淋巴管扩张、淋巴管侵犯以及淋巴结转移的关系。3.采用IHC检测正常区胃壁各层次内淋巴管的密度、面积、周径、扩张度,并分析其与胃癌淋巴结转移的关系。4.应用前哨淋巴结活检及癌旁区淋巴管侵犯预测胃癌淋巴结转移,并分析癌旁区淋巴管侵犯、前哨淋巴管活检以及二者联合应用对胃癌淋巴结转移的预测价值。结果1.胃癌组织内淋巴管的分布与形态特征胃癌中心区无淋巴管;远癌正常区淋巴管形态规则,管腔较大,无淋巴管侵犯;癌旁区淋巴管密度较高,扩张受限,管腔较小,较多淋巴管侵犯,可见肿瘤细胞侵入淋巴管内。2.胃癌癌旁区与远癌正常区淋巴管的比较形态学观察胃癌癌旁区淋巴管平均面积802.12±387.09μm2、平均周径132.35±65.76μm、平均扩张度4.23±2.19分别小于远癌正常区淋巴管的平均面积1511.28±701.21μm2、平均周径196.19±93.72μm、平均扩张度5.08±2.33,差异有统计学意义（P=0.000）。胃癌癌旁区淋巴管密度41.31±15.62个,高于正常区淋巴管密度30.06±11.86个,差异有统计学意义（P=0.000）,胃癌癌旁区淋巴管总面积33139±16352μm2小于正常区淋巴管总面积45424±21824μm2,差异有统计学意义（F=0.008）。胃癌癌旁区淋巴管总周径5467±2040μm与正常区淋巴管总周径5896±2166μm的差异无统计学意义（P=0.229）。3.胃癌癌旁区淋巴管的计量形态学指标与淋巴结转移的关系淋巴结转移组胃癌癌旁区淋巴管密度43.67±16.42个、总面积35866±16678μm2、总周径5851±1897μm、平均面积1050.31±465.47μm2、平均周径161.90±77.13μm、平均扩张度4.50±2.09均高于无淋巴结转移组胃癌癌旁区淋巴管密度33.38±9.02个、总面积23933±10405μm2、总周径4173±2028μm、平均面积723.76±334.75μm2、平均周径123.01±60.88μm、平均扩张度4.19±1.96,差异均有统计学意义（P＜0.05）。4.胃癌癌旁区淋巴管侵犯与淋巴结转移的关系70例患者胃癌癌旁区淋巴管侵犯率为82.86%（58/70）,其中淋巴结转移阳性率为91.38%（53/58）,癌旁区淋巴管侵犯与淋巴结转移有较高的一致性,且二者吻合度强（McNemar Test P=0.219,κ=0.734＞0.7,P=0.000）。阳性预测价值为91.38%（53/58）,阴性预测价值为91.67%（11/12）,准确率为91.43%（64/70）。5.VEGF-C在胃癌中的表达及临床意义VEGF-C mRNA在胃癌组织中的表达率为78.57%（55/70）,高于在正常胃黏膜中的表达率30%（21/70）,（χ2=33.273,P=0.000）。VEGF-C蛋白在胃癌组织中的表达率为72.86%（51/70）,在正常胃黏膜中无表达（χ2=80.225,P=0.000）。VEGF-C阳性组胃癌癌旁区淋巴管密度44.12±16.69个、总面积37604±12914μm2、总周径5927±1898μm、平均面积1183.69±531.49μm2、平均周径167.63±79.18μm、平均扩张度4.78±2.15均高于VEGF-C阴性组胃癌癌旁区淋巴管密度33.89±8.99个、总面积20139±8705μm2、总周径4021±1643μm、平均面积885.89±359.36μm2、平均周径137.67±64.06μm、平均扩张度4.49±2.07（P＜0.05）。VEGF-C阳性表达组胃癌淋巴结转移率92.16%（47/51）高于VEGF-C阴性表达组淋巴结转移率36.84%（7/19）（P=0.000）;LVI的发生率为92.16%（47/51）高于VEGF-C阴性表达组57.89%（11/19）（P=0.002）;Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者的构成比为76.47%（39/51）高于VEGF-C阴性表达组的47.37%（9/19）,（P=0.025）。6.VEGF-D在胃癌中的表达及临床意义VEGF-D mRNA在胃癌组织中的表达率为58.57%（41/70）,高于在正常胃黏膜中的表达率37.14%（26/70）,（χ2=6.440,P=0.011）。VEGF-D蛋白在胃癌组织中的表达率为55.71%（39/70）,高于在正常胃黏膜中的表达率25.71%（18/70）,（χ2=13.050,P=0.000）。VEGF-D阳性组胃癌癌旁区淋巴管密度45.38±18.43个、总面积38898±16991μm2、总周径6126±1842μm,分别高于VEGF-D阴性组胃癌癌旁区淋巴管密度36.26±9.13个、总面积25271±11496μm2、总周径4508±1869μm（P＜0.05）。VEGF-D阳性组胃癌癌旁区淋巴管的平均面积1110±455μm2、平均周径160.55±68.96μm、平均扩张度4.70±2.23,与VEGF-D阴性组胃癌癌旁区淋巴管的平均面积1087±411μm2、平均周径157.43±62.97μm、平均扩张度4.69±2.18相比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。VEGF-D阳性表达组胃癌淋巴结转移率89.74%（35/39）、LVI发生率92.31%（36/39）分别高于VEGF-D阴性表达组胃癌淋巴结转移率61.29%（19/31）、LVI发生率70.97%（22/31）,（P=0.005,P=0.019）。7.胃黏膜固有层淋巴管与胃癌淋巴结转移的关系淋巴结转移组正常区黏膜固有层淋巴管的平均面积649.12±315.19μm2、平均周径131.96±59.19μm、平均扩张度3.88±1.63、总面积12086±5663μm2分别高于无淋巴结转移组胃癌正常区黏膜固有层淋巴管的平均面积437.37±206.51μm2、平均周径107.26±47.72μm、平均扩张度3.07±1.28、总面积8018±3272μm2,差异有统计学意义（P＜0.05）。8.HE、IHC、RT-PCR检测前哨淋巴结癌转移的敏感度染料法行胃癌SLNB的成功率为98.25%（56/57）。全部137个前哨淋巴结均经HE、IHC、RT-PCR检测,HE染色检出阳性淋巴结62个（45.26%）、IHC检出阳性淋巴结71个（51.82%）、RT-PCR检出阳性淋巴结86个（62.77%）,三者检出率的差异有统计学意义（χ2=8.621,P=0.013）,两两比较RT-PCR的检出率高于HE（χ2=8.463,P=0.004＜0.0125）。9.LVI-IHC及SLNB对胃癌淋巴结转移的预测价值SLNB成功的56例患者中淋巴结转移阳性者44例,SLN和非SLN皆阳性者34例,唯有SLN阳性者7例,SLN阴性而非SLN阳性者3例,SLN和非SLN皆阴性者12例。HE、IHC、RT-PCR分别检出前哨淋巴结阳性例数为36例,37例,41例,LVI阳性46例。前哨淋巴结的HE、IHC、RT-PCR检测及D2-40染色显示的癌旁区淋巴管侵犯预测胃癌淋巴结转移状态的准确率分别为85.71%,87.50%,94.64%,98.21%,假阴性率分别为18.18%、15.91%、6.82%、2.27%。联合LVI-IHC和SLNB检测预测胃癌淋巴结转移敏感度100%（44/44）,假阴性率0%（0/44）。10.胃癌浸润深度对SLNB的影响全组SLNB诊断准确率为94.64%（53/56）,假阴性率为6.82%,T1期SLNB诊断准确率为100%（4/4）,T2期SLNB诊断准确率为95.45%（21/22）,假阴性率为6.67%（1/15）,T3期SLNB诊断准确率为93.33%（28/30）,假阴性率7.14%（2/28）。结论1.胃癌淋巴管新生发生于癌旁区;新生淋巴管管腔小,不能代偿淋巴回流之需要,可能是导致肿瘤间质压升高的原因之一;淋巴管新生和淋巴管扩张均可促进胃癌淋巴结转移;通过破坏癌旁区淋巴管壁而进入淋巴流可能是胃癌形成淋巴转移的主要方式;癌旁区LVI-IHC有可能成为准确预测淋巴结转移的敏感指标。2.VEGF-C、D在胃癌组织中均表达上调,在胃癌的淋巴结转移中起重要作用;VEGF-C既可以诱导胃癌癌旁区淋巴管新生及淋巴管扩张,又可以促使淋巴管侵犯、淋巴结转移增加;VEGF-D仅可以诱导淋巴管新生,促使淋巴管侵犯、淋巴结转移增加,未发现其诱导癌旁区淋巴管扩张。3.胃内原有淋巴管可能参与了胃癌淋巴转移过程。4.联合应用癌旁区LVI-IHC和前哨淋巴结活检,可以提高诊断的敏感度,降低假阴性率。
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