人类线粒体转录因子B1和B2的功能研究

论文摘要

人类线粒体转录因子BI&2（TFB1&2）是双功能蛋白。它在线粒体基因组转录中起到辅助作用,它通过与已特异结合在启动子上游的线粒体转录因子A（TFA）及线粒体RNA聚合酶（POLRMT）这两者相互作用,形成起始复合物,促进线粒体转录起始。据文献报道只需要有TFA,TFB2和POLRMT三种蛋白组分便可起始转录,TFB1在转录过程中不是必须的。TFB1&2的C端有一个RNA甲基化转移酶基序,这预示着二者有可能有甲基化转移酶活性。对于两蛋白的这一功能现在仅有的证据为,TFB1可以结合活性甲基供体S。腺苷甲硫氨酸（SAM）,并且有实验证明TFB1蛋白可以代替大肠杆菌中的以16S rRNA C端保守颈环结构为底物的甲基化转移酶Ksg,甲基化底物核糖核苷酸。裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是良好的模式生物,其基因组中50个基因与人类疾病致病基因相似,是研究人类基因疾病的良好材料。另外人类的TFB1&2的发现也与裂殖酵母有直接关系。本文以探讨h-mtTFB1&2与裂殖酵母线粒体转录因子（MTF1）功能上的相似性,及TFB1&2甲基化转移酶活性初步探索为目的进行了下面实验：1.TFB1&2与MTF1功能上的相似性：构建pREP3-tfb1&2-GFP融合质粒,并转化入裂殖酵母体内,利用荧光显微镜观察到TFB1&2蛋白定均定位于酵母线粒体；构建pREP3-tfb1&2质粒,获得TFB1&2过表达的酵母菌株,利用real-timePCR检测到酵母线粒体基因在TFB1过表达时,大部分基因上调,而TFB2过表达时大部分基因表达下调；利用大肠杆菌蛋白表达系统,表达纯化出TFB1&2,用pull-down实验检测到两个蛋白可以与裂殖酵母的线粒体RNA聚合酶Rpo41相互作用。2.TFB1&2甲基化转移酶活性初探：利用荧光分子各异性实验在加有荧光标记的人类线粒体12S rRNA体系中滴定TFB1&2,检测两个蛋白与RNA的结合行为,结果显示两个蛋白均可与RNA结合；利用pull down实验检测TFB1自身结合行为,结果显示TFB1可形成同质多聚体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 综述
• 1. 人类TFB1&2的发现
• 2. 粒体基因组
• 2.1 线粒体基因组组成
• 2.2 线粒体基因组遗传方式
• 3. 线粒转录机制
• 3.1 线粒体转录起始复合物成分
• 3.2 线粒体转录的起始
• 3.3 转录的终止调控
• 4. TFB1的甲基化功能
• 4.1 h-mtTFB1的甲基转移酶活性与抗生素诱导的耳聋相关
• 4.2 12S rRNA特定位点的甲基化有助于线粒体核糖体的稳定性
• 4.3 RNA甲基化的检测方法
• 4.4 RNA甲基转移酶以同源二聚体形式行使甲基化转移酶的功能
• 第二章 人类线粒体转录因子B1和B2与裂殖酵母的线粒体转录聚合酶Rpo41的相互作用研究
• 1. TFB1&2在酵母中的定位
• 1.1 实验材料和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 小结
• 2. TFB1&2对裂殖酵母线粒体基因表达的影响
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实时荧光定量PCR结果
• 2.4 小结
• 3. TFB1&2与酵母线粒体RNA聚合酶Rpo41的相互作用初探
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 小结
• 第三章 TFB的甲基化转移酶活性初步研究
• 1 TFB1&2与mt12S rRNA结合研究
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 小结
• 2. TFB1&2各自可以形成同质多聚体的初步研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 小结
• 全文展望
• 参考文献
• 致谢