论文摘要
第一部分PGRN与宫颈癌的相关性及其信号转导通路的研究宫颈癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤之一,仅次于乳腺癌。2008年全球估计新发宫颈癌病例52.98万,死亡病例25.51万人,其中85%新发病例在发展中国家。在我国,每年新增的宫颈癌病人达15万人左右,有大约2万名妇女死于这种疾病。宫颈癌的发病率逐年上升,并呈年轻化趋势。人乳头瘤病毒（Human papilloma viruse, HPV）是引起宫颈癌病变的首要因素。HPV是一类无包膜的DNA病毒,属乳多空病毒科,根据其是否引起恶性病变,HPV分为两种：低危型（如HPV6和HPV11等）和高危型（HPV16和HPV18等）。高危型的HPV与宫颈癌的发生有密切的关系,尤其是HPV16和HPV18。其中E6和E7是高危型HPV感染最重要的两个癌基因,病毒基因组整合到人基因组增强了E6和E7的表达升高,E6和E7可分别抑制抑癌蛋白p53和Rb的表达,从而促进了细胞的增殖和恶性转化。颗粒蛋白前体（progranulin, PGRN）是一种自分泌生长因子,最初在侵袭性小鼠畸胎瘤中被发现。PGRN是一类组织分布广泛、功能多样的生长因子,参与了早期胚胎发生、伤口修复、生长发育等多种重要的生理活动。研究表明,PGRN在多数肿瘤细胞中高度表达,在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌和肝癌等肿瘤中具有致瘤功能,乳腺癌、卵巢癌和肝癌等中PGRN的高表达与肿瘤恶化相关,子宫内膜癌和子宫平滑肌肉瘤的免疫组化分析发现PGRN水平与肿瘤的组织学分级呈正相关,表明PGRN具有用作肿瘤诊断标志物的潜力。PGRN可激活典型的生长因子信号途径,包括Erk信号途径中shc和p42/44MAPK与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径中PI3K、蛋白激酶B/Akt和p70S6激酶的磷酸化。PGRN可启动结合素（integrin）相关信号途径中胞浆酪氨酸激酶--成簇黏附激酶（FAK）的磷酸化。在膀胱癌细胞中PGRN驱使FAK与桩蛋白和p44/p42MAPK的结合,暗示PGRN和细胞外基质信号可能存在相关性。近期,在胆管上皮癌中发现IL-6诱导的PGRN可以通过Akt依赖性的机制调控叉头状转录因子O1（forkhead transcription factors O1, FoxO1）的活性,从而促进细胞增殖。目前,PGRN在宫颈癌中的表达及功能还未见报道。本论文针对PGRN在宫颈癌中的表达,PGRN的表达对宫颈癌发生、发展的影响,以及对相关信号途径的调控做了初步的探讨。一、PGRN在宫颈癌中的表达本研究使用免疫组织化学法（Immunohistochemistry, IHC）检测了正常宫颈、宫颈癌组织的石蜡切片中PGRN的表达。实验结果显示,宫颈癌组织中PGRN表达明显高于正常宫颈组织。此外,使用western blot检测了宫颈癌细胞HeLa （HPV18+）、SiHa （HPV16+）和宫颈永生化细胞H8中PGRN的蛋白水平和培养基内的分泌性PGRN的表达差异。Western blot和Elisa检测结果发现,宫颈永生化细胞H8的胞内和分泌性PGRN表达最低,而宫颈癌细胞HeLa表达最高。宫颈癌的形成与高危型HPV E6和E7蛋白密切相关,为了分析PGRN与癌蛋白E7之间是否存在相关性。本研究使用高表达HPV16-E7的人视网膜色素上皮（RPE1）细胞系,通过western blot检测发现稳定表达HPV16-E7的RPE1细胞（RPE116E7）的PRGN的表达水平明显高于RPE1对照细胞,提示HPV16-E7可能是诱导宫颈上皮细胞中PGRN表达水平增高的关键诱导因素。本研究还调查了其他诱导因素对PGRN表达的影响,发现IL-6、雌激素均可促进PGRN在宫颈上皮细胞或宫颈癌细胞中的表达。上述研究结果表明,在宫颈癌组织中、宫颈癌细胞内或胞外,PGRN均存在高表达现象。在宫颈上皮细胞中,HPV16-E7、IL-6和雌激素是可能造成PGRN表达上调的诱导因素。由此推测PGRN有可能通过某些途径参与了宫颈癌的恶性转化。二、PGRN对宫颈癌发生、发展的影响为检测PGRN是否影响宫颈上皮细胞的细胞行为,本研究使用重组人PGRN （recombinant human PGRN, rhPGRN）处理H8细胞,或使用干扰RNA与表达载体分别抑制HeLa细胞与增强H8细胞内PGRN的表达水平,进而检测其细胞增殖、克隆形成、细胞迁移等能力。结果显示,外源性PGRN处理和PGRN内源性高表达均促进了永生化细胞H8的增殖活性,克隆形成和迁移的能力。而干扰PGRN表达后,宫颈癌细胞系HeLa的细胞增殖能力显著下降。体内动物实验中发现,PGRN低表达可显著抑制HeLa细胞在裸鼠中的肿瘤生长能力。此外,将HPV癌基因E6/E7和Ha-ras转化的小鼠肺上皮细胞TC-1接种于PGRN基因敲除小鼠和野生型小鼠,结果显示TC-1细胞在基因敲除小鼠成瘤能力较野生型小鼠显著降低。相反,永生化宫颈上皮细胞H8接种的裸鼠,分别进行rhPGRN腹腔或瘤体注射可导致H8细胞成瘤。本研究进一步检测了PGRN对抑癌基因Rb和p53的表达影响,发现H8细胞经rhPGRN刺激后,Rb和p53的表达均明显降低。以上体外和体内研究均表明,PGRN可以促进宫颈癌永生化细胞的生长增殖和恶性转化能力,而采用特异性siRNA干扰PGRN表达则导致宫颈癌细胞HeLa的增殖能力的降低。PGRN促进宫颈上皮细胞增殖等细胞行为可能与PGRN降低p53、pRb表达有关。三、PGRN对PI3K/Akt/mTOR信号途径的影响PI3K/Akt/mTOR信号途径在癌症中的作用一直以来都是肿瘤相关研究的热点之一。PI3K/Akt与Erk信号均参与调控雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号途径,Akt、 p70S6K以及FoxO1也均为mTOR信号途径的成员,提示PGRN激活的PI3K/Akt和Erk途径可能涉及mTOR信号途径。本研究首次较为全面的检测了PGRN对PI3K/Akt/mTOR信号途径的影响,结果显示PGRN激活了宫颈上皮永生化细胞H8中Akt和mTOR的磷酸化并调控了mTORC1下游信号途径分子p70S6K、4E-BP1、FoxO1等的活性。PI3K/Akt抑制剂LY2940002的加入阻止了PGRN诱导的nTOR的激活,说明了PGRN诱导的mTOR磷酸化依赖于PI3K的活性。同时PGRN也可促进mTORC2的活性,重组PGRN处理H8细胞可诱导mTORC2下游分子Akt473位丝氨酸磷酸化,促进Akt控制的凋亡基因相关转录因子FoxO1的磷酸化和出核失活。以上结果显示PGRN激活了Akt/mTOR信号途径,而Akt/mTOR信号途径影响到许多重要的细胞功能,在调控基本的细胞行为如细胞生长、增殖与存活中具有关键作用。本研究进一步证实了PGRN诱导的细胞增殖和抗凋亡等功能与PGRN激活的PI3K/Akt/mTOR信号途径具有重要的相关性,从而能部分解释了PGRN调控宫颈癌细胞增殖的原因。综上所述,本研究首次提出PGRN与宫颈癌的密切相关性。初步探讨了PGRN在宫颈癌细胞中表达的诱导因素以及PGRN促进宫颈癌发生、发展的功能及其信号转导机制。本研究揭示了微环境因素对宫颈癌发病机制的影响,为包括宫颈癌在内的PGRN相关肿瘤提供了新的治疗靶位,有助于抗癌药物的优化和创新。第二部分RbAp48调控宫颈癌细胞放射敏感性的研究宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,其发病率位居妇女恶性肿瘤第2位。尤其是近年来出现全球发病年轻化趋势,严重威胁着广大妇女的健康。据WHO统计,全球每年新发宫颈癌病例50万,约80%的病例发生在发展中国家,中国约有15万人,其中每年全球的死亡病例约20万。大量研究资料表明人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）是宫颈癌发生的首要启动因子。HPV是一种无包膜的小DNA病毒,其中HPV16、18亚型对宫颈移行带具高度亲和力,与宫颈癌关系最为密切。HPV的转化基因主要包括病毒的早期基因E6和E7,该基因编码的蛋白产物与细胞生命周期的活性蛋白相互作用,使细胞分化、增殖和凋亡紊乱,诱发肿瘤的形成。RbAp48,作为一种广泛存在的Rb蛋白结合蛋白,能够协同其他蛋白调节组蛋白及其核小体相关组蛋白乙酰转移酶（HDAC）复合物的构型和活性,从而抑制E2F调控基因的转录调节。我们课题组之前的研究首先报道了RbAp48是一种具有调控HPV阳性宫颈癌转化活性的重要蛋白,RbAp48在宫颈癌中低表达,在HPV阳性宫颈癌细胞系中过表达RbAp48能够抑制细胞的生长增殖及肿瘤形成,其机制与RbAp48调节HPV癌基因E6、E7、c-myc,抑癌基因Rb、p53以及Rb/E2F靶位基因的表达有关,提示RbAp48有可能作为一种HPV相关肿瘤的治疗靶位。新近研究发现,RbAp48也是一种放射敏感性蛋白。在对肿瘤细胞放射敏感性相关基因的筛选中,RbAp48作为被鉴定出来的三个重要基因中的其中之一,其在放射敏感细胞系中的表达明显高于放射耐受细胞系。将RbAp48转入乳腺癌细胞系HS-578T、MDA-MB-231以及黑色素瘤细胞系MALME-3M后,能够明显增加细胞周期中放射敏感阶段G2/M的细胞比例,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。目前宫颈癌的治疗方法主要是手术和放疗,尤其晚期以放疗为主。与前列腺肿瘤、头颈部软组织肿瘤以及其它肿瘤类似,宫颈癌的治愈率在很大程度上取决于肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。迄今,RbAp48与宫颈癌放射敏感性的关系尚未见报道。本研究在以往研究的基础上将重点探讨RbAp48与宫颈癌细胞放射敏感性的关系及其作用机制。一、RbAp48在放射后宫颈癌细胞中的表达本研究将确定在宫颈癌中RbAp48是否是一种放射敏感性蛋白,即RbAp48的表达在射线照射前后是否有差别,以及这种差别是否决定细胞的放射敏感性。采用免疫印迹和实时定量PCR检测HPV阳性宫颈癌细胞SiHa、Caski和HeLa细胞在x-射线照射前后的RbAp48表达水平差异,结果显示照射后的RbAp48在mRNA水平和蛋白水平均显著升高,从而确定RbAp48在宫颈癌细胞中是放射敏感蛋白。二、RbAp48对宫颈癌细胞放射敏感性的影响本研究分别自抑制RbAp48和过表达RbAp48的角度,观察干预RbAp48对宫颈癌细胞生长增殖及细胞放射敏感性的影响。用pcDNA3.1-RbAp48转染SiHa Caski和HeLa细胞后构建稳定过表达RbAp48的细胞系,用RbAp48特异的小干扰RNA和阴性对照siRNA分别转染细胞抑制细胞内RbAp48的表达。细胞接受不同剂量X-射线处理后,通过CCK-8试剂、细胞计数、平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验观察RbAp48对宫颈癌细胞放射敏感性的影响。实验结果显示,RbAp48过表达能显著抑制照射处理后细胞的增殖,克隆形成和恶性程度。而抑制RbAp48的表达,则能降低射线对细胞增殖生长的抑制作用。进一步说明RbAp48确实能提高宫颈癌细胞的放射敏感性三、RbAp48提高宫颈癌细胞放射敏感性的机制研究有研究报道RbAp48能够明显增加乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞细胞周期中放射敏感阶段G2/M的细胞比例,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。本研究将从细胞周期、细胞凋亡和肿瘤相关基因分析对RbAp48促进宫颈癌细胞放射敏感性的机制作初步探讨。采用流式细胞术分别检测过表达RbAp48、干扰RbAp48的宫颈癌细胞和对照细胞经x-射线照射前后细胞周期和细胞凋亡的变化。实时定量PCR检测照射前后各细胞中肿瘤相关基因p53,Rb和Caspase-8的表达变化。实验结果显示,改变宫颈癌细胞内RbAp48的表达或单独射线处理均能一定程度的影响细胞周期和凋亡。过表达RbAp48能明显引起射线处理宫颈癌细胞的G2/M阻滞和细胞凋亡；而射线引起的宫颈癌细胞G2/M期细胞比例和凋亡细胞数的升高,在细胞内RbAp48表达被抑制后明显下降。实时定量PCR结果同样显示了过表达RbAp48或抑制RbAp48和射线处理均能够改变SiHa、Caski和HeLa细胞中的p53、Rb和Caspase-8的表达水平。但过表达RbAp48联合射线治疗更为显著的增强了p53、Rb和Caspase-8的表达水平,而干扰宫颈癌细胞RbAp48后,射线引起的p53、Rb和Caspase-8的表达升高明显受到抑制。以上结果表明,宫颈癌细胞内RbAp48的表达变化能显著影响细胞照射后的细胞周期、细胞凋亡以及肿瘤相关基因的表达水平,说明RbAp48促进宫颈癌放射敏感性的作用是通过阻滞细胞周期G2/M期、增加细胞凋亡、促进抑癌基因p53和Rb以及凋亡相关基因Caspase-8的表达来实现的。四、腺病毒介导的RbAp48高表达对宫颈癌细胞放射敏感性的影响为进一步确定RbAp48在宫颈癌放射敏感性中的生物学功能,我们构建了RbAp48重组腺病毒（Ad5-RbAp48）,并进行了动物体内实验。Western blot结果显示,Ad5-RbAp48能有效提高细胞中RbAp48的表达水平。裸鼠接种宫颈癌细胞SiHa和HeLa成瘤后,分别接受Ad5-RbAp48治疗、射线治疗和Ad5-RbAp48协同射线联合治疗,观察裸鼠体内成瘤的差异。实验结果显示, Ad5-RbAp48协同射线治疗能有效的抑制宫颈癌细胞成瘤,提高治疗效果。说明腺病毒介导的RbAp48高表达明显提高了宫颈癌细胞的放射敏感性。综上所述,本研究首次提出了RbAp48与宫颈癌放射敏感性之间的密切关系,并初步探讨了RbAp48提高宫颈癌细胞放射敏感性的相关机制。结果显示,x-射线能引起宫颈癌细胞系SiHa、Caski和HeLa细胞内RbAp48的表达升高,上调RbAp48表达能够促进宫颈癌细胞的放射敏感性,相反干扰RbAp48的表达后则会降低宫颈癌细胞对射线的敏感性。RbAp48影响宫颈癌细胞放射敏感性的机制与细胞G2/M期阻滞,细胞凋亡和抑癌基因表达增加密切相关。裸鼠体内成瘤实验进一步证实Ad5-RbAp48协同射线治疗能有效的抑制宫颈癌细胞生长及成瘤力。以上研究为宫颈癌的临床放疗联合基因治疗奠定了实验基础,有重要的实际应用价值。