EGFR基因家族shRNA真核表达载体构建及其对SKOV3细胞的影响

论文摘要

第一部分:EFGR基因家族shRNA真核表达质粒的构建目的:构建针对EGFR家族的shRNA干扰质粒表达载体,为本课题下一步研究提供有力工具。方法:选择放疗不敏感的卵巢癌细胞SKOV3中高表达的EGFR家族同源性基因为靶基因,根据shRNA的设计原则,设计实验组及对照组shRNA。体外合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体pGensil-1的pol III启动子下游。分别命名为pGensil-1-E及pGensil-1-C。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果:经酶切和DNA测序鉴定结果完全符合设计要求,成功构建了EGFR家族同源性基因的RNA干扰表达载体, pGensil-1-E及pGensil-1-C。为下一步体外、体内实验奠定了基础。结论:本实验应用RNAi技术,成功构建了EGFR家族同源性基因的RNA干扰表达载体, pGensil-1-E及pGensil-1-C。第二部分RNA干扰EGFR家族对人卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的影响目的:将重组质粒载体转染卵巢癌SKOV3细胞,观察其对SKOV3增殖活性的影响。方法:利用脂质体2000转染细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系。利用MTT检测细胞增殖活性。利用RT-PCR、Western Blot检测稳定细胞mRNA、蛋白水平变化。结果:建立了RNA干扰重组质粒载体稳定转染SKOV3细胞。MTT:pGensil-1-E组较对照组细胞增殖抑制率24h、48h、72h分别为:59.7﹪、81.2﹪、87.8﹪。RT-PCR: pGensil-1-E组较对照组细胞瞬时转染及稳定转染HER2 mRNA表达率下降至:32.9﹪、21.7﹪。Western Blot:pGensil-1-E组较对照组细胞稳定转染P185表达率下降至:21.8﹪。结论:获得了在mRNA水平及蛋白水平上HER2表达均受到明显抑制的稳定转染卵巢癌SKOV3细胞系。为本课题下一步卵巢癌放疗增敏实验提供理论指导和实验依据。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
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• 论文正文：EGFR 基因家族shRNA 真核表达载体构建及其对SKOV3 细胞的影响
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 EFGR 基因家族shRNA 真核表达质粒的构建
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 RNA 干扰EGFR 家族对人卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 附图
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 发表第一作者论文目录