蔗糖转运蛋白VvSUC11、VvSUC12在提高甜菜含糖量中作用的研究

论文摘要

VvSUC11和VvSUC12是葡萄蔗糖转运蛋白,已有的研究表明二者的功能是负责蔗糖从质外体向薄壁细胞装载,在葡萄成熟时果实糖分积累中起重要作用。在农业生产实践中,为了获得高产量,人们不仅要设法提高农作物光合作用形成的生物产量,而且要通过一定的措施来提高其经济器官的产量；因此,利用蔗糖转运蛋白来定向的提高农作物经济器官的产量,是一种调控库源关系的有效手段。为了研究蔗糖转运蛋白能否提高甜菜含糖量,本研究将葡萄蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12与甘薯的甘薯贮藏蛋白（sporamin）基因的根部特异性启动子命名为SP1和SP2重组。以实验室保存的pCAMBIA2301为起始载体构建了用于转化甜菜的双价植物表达载体PCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12。甜菜是两年生异交草本植物,因为其栽培驯化的时间较短,遗传背景狭窄,种质资源贫乏；特别是甜菜自交高度不亲和性,使得优良甜菜单株的基因型因不能遗传而很容易丢失,给优良选育材料品种的繁殖和保存带来了很大的困难。现代生物技术的发展,特别是基因工程的发展给甜菜育种方法开辟了一条新途径。可以通过植物组织培养和基因工程相结合的方法进行甜菜的分子育种。目前关于甜菜组织培养的众多研究表明,甜菜可以采取直接器官发生再生植株方式（不经历愈伤组织阶段）进行组织培养,而且用这种方式获得的再生苗更适合作为转化外源基因的受体材料。研究表明,甜菜的叶柄作为外植体,其再生频率较高,遗传转化后,其转化率也较高。本研究建立了甜菜叶柄高效直接再生体系。试验通过种植无菌甜菜苗、无菌苗预培养、叶柄的诱导分化培养,不定芽的产生和生根,获得了完整的再生植株,建立了甜菜再生体系。试验结果表明：甜菜种子消毒后在1/2MS培养基中生长10 d左右,取出幼苗除根后在预培养培养基（MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L）的中预培养50-60 d,然后取其叶柄作为外植体在诱导分化培养基（MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L）中进行不定芽诱导,不定芽的诱导率在50%以上；将不定芽移到生根培养基（MS+IBA2.0mg/L）中诱导生根,诱导生根率在90%以上。用农杆菌介导法将载体PCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12转化甜菜KWS-9103品种,发现预培养4d,侵染时农杆菌的浓度OD600值为0.5附加0.005%表面活性剂：Silwet L-77,延迟筛选4d,转化效率最高,可达42%。对在卡那霉素中分化并生根的甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,证明了目的基因已整合到甜菜中并表达,为研究其能否提高甜菜的含糖量奠定了坚实的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国甜菜育种的研究进展及存在的问题
• 1.1.1 甜菜育种的研究进展
• 1.1.2 甜菜育种存在的问题
• 1.2 新疆甜菜育种的进展及存在的问题
• 1.2.1 新疆甜菜育种的进展
• 1.2.2 新疆甜菜育种存在的问题
• 1.3 甜菜基因工程的研究进展
• 1.3.1 甜菜抗病基因工程
• 1.3.2 甜菜抗虫基因工程
• 1.3.3 其他方面
• 1.4 蔗糖转运蛋白的研究进展
• 1.4.1 蔗糖转运蛋白的存在
• 1.4.2 蔗糖转运蛋白的结构和性质
• 1.4.3 植物中蔗糖转运蛋白的亚群、特征和功能
• 1.4.4 蔗糖载体蛋白间的互作模式
• 1.4.5 葡萄蔗糖转运蛋白的研究进展
• 1.5 甜菜再生体系的研究进展
• 1.6 甜菜遗传转化体系的研究进展
• 1.6.1 甜菜的遗传转化方法的研究进展
• 1.6.2 提高甜菜遗传转化频率的研究进展
• 1.7 结束语
• 第二章 蔗糖转运蛋白基因VvSUC11和VvSUC12双价植物表达载体的构建及农杆菌的转化
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和菌种
• 2.1.2 分子生物学常用酶及试剂盒
• 2.1.3 分子生物学常用培养基的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 双价植物表达载体pCAMBIA2301-SP1-VvSUC11-SP2-VvSUC12的构建
• 2.2.2 双价植物表达载体用冻融法转化根癌农杆菌GV3101
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 双价植物表达载体pCAMBIA2301-SP1-VvSUCl1-SP2-VvSUC12的构建和鉴定
• 2.3.2 双价植物表达载体转化根癌农杆菌和PCR鉴定
• 第三章 甜菜叶柄高效直接再生体系的建立
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂材料
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 培养基配制与配方
• 3.2.2 种子消毒与接种
• 3.2.3 预培养
• 3.2.4 不定芽诱导
• 3.2.5 诱导生根
• 3.2.6 植株移栽
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 消毒方法对种子萌发的影响
• 3.3.2 预培养时激素组合对幼苗生长的影响
• 3.3.3 外植体不经过愈伤阶段直接诱导出不定芽
• 3.3.4 生根和移栽
• 第四章 甜菜高效遗传转化体系的建立及转基因甜菜的鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂材料
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 农杆菌介导法转化甜菜
• 4.2.2 转基因甜菜的PCR及RT-PCR检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 双价植物表达载体转化甜菜和甜菜遗传转化体系的建立
• 4.3.2 转基因甜菜的PCR及RT-PCR检测
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.1.1 成功构建了双价植物表达载体
• 5.1.2 建立了甜菜叶柄高效直接再生体系
• 5.1.3 建立了甜菜高效遗传转化体系
• 5.1.4 已获得转目的基因甜菜植株
• 5.2 讨论
• 5.2.1 蔗糖转运蛋白的功能
• 5.2.2 甜菜叶柄直接再生体系的优化
• 5.2.3 甜菜遗传转化体系的优化
• 5.3 本实验的创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表