一种新型海洋纤溶酶的研究

论文摘要

血栓性疾病是西方富裕国家人类死亡的首要原因。它主要危害心、脑、肺的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在美国,每年大约有60万人发生肺栓塞,其中约20万人死亡;每年约有100万人发生急性心肌梗塞,其中20多万人需要住院进行治疗。在我国,每年大约有200万人死于栓塞性心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万。并且,这类疾病的发病率也有逐年上升趋势。血栓性疾病的主要治疗手段是溶栓,迄今溶栓剂已发展了三代,但都有一定的副作用。有鉴于此,我们从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:1.单环刺螠纤溶酶在单环刺螠的血液及内脏组织中含量丰富,其大量制备工艺为:体腔液及内脏混合物经匀浆、PBS抽提、（NH4）2SO4分级盐析、超滤、Q.Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75、Sephacry S-100层析分离,最终获得纯酶。经过优化的本工艺可以高效率地提取这种新型海洋纤溶酶,并达到了电泳纯,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条带。2.经SDS-PAGE和Native-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,单环刺螠纤溶酶分子量约为10,380 Da。与已经发现的陆地生物来源的纤溶酶以及海洋生物来源的纤溶酶相比,分子量相对较小。而苯酚-硫酸法测定糖含量表明,单环刺螠纤溶酶含糖量极低,所以可能不是糖蛋白。3.与蚓激酶类似,单环刺螠纤溶酶既可直接水解纤维蛋白,又具有激酶活性,通过激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地水解纤维蛋白。因而该酶具有很高的纤维蛋白亲合性和酶活力。以尿激酶为对照,测得酶的比活力为5256 U/mg。4.单环刺螠纤溶酶体外抗凝实验结果表明,不同浓度的酶均具有显著的抗凝作用,并且酶浓度越高,抗凝效果也越好。在酶浓度相同的情况下,单环刺螠纤溶酶的抗凝效果要优于蚓激酶。而且,单环刺螠纤溶酶作用相对温和,对细胞损

论文目录

• 摘 要
• Abstract
• 第一章 文献综述和立论依据
• 第一节 文献综述
• 1 溶栓剂的国内外研究现状及发展趋势
• 1.1 血栓性疾病及其危害
• 1.2 凝血与抗凝的基本原理
• 1.2.1 凝血系统
• 1.2.2 抗凝系统
• 1.2.3 纤溶系统
• 1.3 血栓性疾病的治疗
• 1.3.1 血栓性疾病的治疗策略
• 1.3.2 不同治疗策略的评价与联用
• 1.4 溶栓剂分类与作用途径
• 1.4.1 传统分类
• 1.4.2 现有分类系统的缺陷
• 1.4.3 现有溶栓剂的作用途径
• 1.5 新型天然溶栓剂与具有临床应用前景的纤溶酶
• 1.5.1 动物来源
• 1.5.2 微生物来源
• 1.5.3 植物来源
• 1.6 新型溶栓剂的开发及发展趋势
• 1.6.1 现有溶栓剂的主要缺陷
• 1.6.2 新型溶栓剂的来源及开发途径
• 1.6.3 溶栓剂的发展趋势
• 2 海洋心脑血管药物及活性物质研究概况
• 2.1 研究现状
• 2.1.1 糖类及其衍生物
• 2.1.2 脂类
• 2.1.3 蛋白及糖蛋白类
• 2.1.4 氨基酸及多肽
• 2.1.5 甾醇、皂甙、核苷、萜类及生物碱
• 2.1.6 含氮混合物
• 2.1.7 三丙酮胺及喹啉酮
• 2.1.8 其他
• 2.2 开发策略与前景展望
• 2.2.1 海洋心脑血管药物研究的难点
• 2.2.2 海洋心脑血管药物的开发策略
• 2.2.3 前景展望
• 3 海洋无脊椎动物单环刺螠研究进展
• 3.1 生物学特性
• 3.1.1 形态解剖
• 3.1.2 区系分布
• 3.1.3 分类
• 3.1.4 生态习性
• 3.1.5 耐受力
• 3.1.6 生活史
• 3.1.7 人工培养与繁殖
• 3.2 细胞、生化及分子生物学研究
• 3.2.1 生物活性物质
• 3.2.2 分类地位
• 3.2.3 消化与营养
• 3.2.4 硫化物耐受机制
• 3.2.5 发育
• 3.3 应用情况及潜在开发价值
• 3.3.1 海洋功能保健品
• 3.3.2 海洋药物
• 3.3.3 海洋环境保护
• 3.3.4 未来展望
• 第二节 立论依据
• 1 选题依据与背景情况
• 2 课题研究的目的与意义
• 2.1 课题研究的目的
• 2.2 课题研究的意义
• 第二章 单环刺螠纤溶酶的寻找与分离纯化
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 单环刺螠
• 1.2 Wistar 大鼠
• 1.3 试剂与仪器
• 1.4 不同组织粗提物的制备
• 1.5 具有溶栓作用效果的纤溶酶的筛选
• 1.6 酶活力测定
• 1.7 蛋白浓度测定
• 1.8 纤溶酶的分离纯化步骤
• 1.8.1 酶的抽提
• 1.8.2 粗品制备
• 1.8.3 酶的精制
• 1.9 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2 结果
• 2.1 不同组织粗提物的溶栓作用效果
• 2.2 酶的分离制备工艺
• 2.2.1 层析纯化
• 2.2.2 纯度鉴定与分子量测定
• 2.2.3 制备工艺路线
• 2.2.4 分离纯化总结
• 3 讨论
• 3.1 纤溶酶在单环刺螠体内的分布
• 3.2 单环刺螠体内纤溶酶含量丰富
• 3.3 单环刺螠纤溶酶可能包含一组同工酶
• 3.4 单环刺螠纤溶酶制备工艺的优化
• 3.5 小分子量纤溶酶作为溶栓药物具有潜在的优越性
• 4. 小结
• 第三章 单环刺螠纤溶酶的物理化学性质研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂与仪器
• 1.2 糖含量测定
• 1.3 酶活力测定
• 1.4 温度对酶稳定性的影响
• 1.5 pH 对酶稳定性的影响
• 1.6 金属离子对酶稳定性的影响
• 1.7 温度对酶活力的影响
• 1.8 pH 对酶活力的影响
• 1.9 金属离子对酶活力的影响
• 2 结果
• 2.1 酶蛋白的糖含量
• 2.2 酶的热稳定性
• 2.3 酶的pH 稳定性
• 2.4 酶的金属离子稳定性
• 2.5 最适温度
• 2.6 最适pH
• 2.7 酶的激活剂与抑制剂
• 3 讨论
• 3.1 铁离子对酶活性的调控作用
• 3.2 酶的稳定性及最适反应条件的意义
• 4 小结
• 第四章 单环刺螠纤溶酶的激酶活性与动力学研究
• 前言
• １材料与方法
• 1.1 试剂与仪器
• 1.2 酶活力测定
• 1.2.1 平板制作
• 1.2.2 溶液配制
• 1.2.3 测定
• 1.3 激酶活性测定
• 1.4 底物浓度对酶反应速度的影响
• 1.5 测定酶的动力学参数
• 2 结果
• 2.1 酶的活力测定
• 2.2 激酶活性测定
• 2.3 底物浓度与酶反应速度的关系
• 2.4 酶的动力学常数
• 3 讨论
• 3.1 单环刺螠纤溶酶作为溶栓剂的作用机制
• 3.2 底物浓度对酶反应速度的影响
• 4 小结
• 第五章 单环刺螠纤溶酶的体外抗凝与溶栓研究
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 蚓激酶提取
• 1.3 酶的抗凝活性检测
• 1.4 酶的溶栓活性检测
• 1.5 酶的血栓溶解率计算
• 1.6 单环刺螠纤溶酶与蚓激酶组分比较
• 2 结果
• 2.1 单环刺螠纤溶酶的抗凝效果
• 2.1.1 酶的抗凝效果观察
• 2.1.2 不同浓度的酶的抗凝效果
• 2.1.3 酶对细胞损伤的显微镜观察
• 2.2 单环刺螠纤溶酶的溶栓效果
• 2.2.1 酶的溶栓效果观察
• 2.2.2 不同浓度酶的溶栓效果
• 2.2.3 酶对细胞损伤的显微镜观察
• 2.2.4 酶对 Wistar 大鼠血栓的溶解作用
• 2.3 酶的血栓溶解率
• 2.4 单环刺螠纤溶酶与蚓激酶所含的组分
• 3 讨论
• 3.1 酶活性对溶栓及抗凝作用效果的影响
• 3.2 酶的毒性与副作用
• 3.3 临床应用前景
• 4 小结
• 论文总结
• 参考文献
• 英文缩写
• 致谢