论文摘要
为了筛选一些在早期胚胎发育过程中起作用的蛋白,本实验室构建了小鼠卵细胞激活前后的蛋白谱系,通过质谱鉴定、生物信息学分析及相关文献查阅,我们选择了Skp1这个蛋白进行了深入的功能研究。前人有研究报道了在酵母中Skp1能参与纺锤体checkpoint的激活及信号的传递,此外,它还在许多关键的细胞通路中起重要作用,这些结果提示Skp1可能在胚胎早期发育过程中起相当重要的作用。在本研究中,我们首先构建了小鼠激活前后卵细胞的蛋白谱系。从2D胶上我们得到以下信息:Skp1在激活前后卵细胞中表达较多,其表达量在激活前后无明显变化;Skp1在2D胶上呈不同分子量的上下两排分布,推测其可能是一种糖基化的修饰。随后我们运用westernblot方法进一步验证了skp1存在于小鼠卵细胞及孤雌激活卵细胞中。其表达情况与2D胶上的情况类似,即表达量不随激活而改变,呈不同分子量的上下两行分布,下面一行蛋白的分子量与理论分子量18700Da较接近。免疫组织化学的结果显示Skp1主要定位于各级卵母细胞的胞浆中,另外黄体中也有少量分布。免疫荧光的结果与免疫组化的结果类似,Skp1主要定位于卵细胞及各级胚胎的胞浆中,并且其表达量及表达定位随胚胎发育不发生改变。为研究Skp1蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中发挥的作用,我们首先构建了pEGFP-Skp1-C2超表达质粒,通过显微注射的方法将其注射至受精卵原核中然后观察受精卵的发育情况,结果发现相对于对照组胚胎,超表达skp1蛋白的胚胎的发育受到不同程度的阻滞,有较多的胚胎不能正常致密化而发育至囊胚阶段,以上结果提示Skp1蛋白超表达能阻滞小鼠早期胚胎的发育。为进一步验证以上实验结果,我们将Skp1抗体注射至受精卵中然后观察胚胎的发育情况。结果显示受精卵进行Skp1抗体注射后其发育得到了促进,在相同的时间内抗体组胚胎的发育要快于对照组胚胎的发育。这些实验结果证实了Skp1蛋白的阻断能促进小鼠早期胚胎的发育,这也与上面超表达实验的结果是一致的。得到以上的实验表型,我们接下来研究Skp1影响小鼠早期胚胎发育的机制。前人有研究显示在酵母中,Skp1能与纺锤体checkpoint蛋白相互作用从而参与纺锤体checkpoint激活与信号的传递,那么Skp1蛋白的阻断就会导致这一监督机制的废除从而使本该被阻止发育的非正常细胞能够继续发育下去。鉴于我们得到的实验表型与此相符,即Skp1抗体阻断后胚胎的发育得到促进,因此我们进一步研究这些注射过抗体后的胚胎。首先我们使用免疫荧光的方法观察经过Skp1抗体注射处理后的卵细胞和胚胎的纺锤体形态,结果显示卵细胞经过Skp1抗体注射处理后其纺锤体形态出现异常的机率大大提高,异常率接近40%,明显高于阴性对照组和空白对照组的10.3%和5.4%。纺锤体的异常包括出现多极纺锤体,纺锤丝散乱不规则,纺锤体形态畸形甚至出现断裂。另外,相对于正常卵细胞染色体规则紧密排列于赤道板,注射Skp1抗体后的卵细胞其染色体出现排列松散紊乱的机率也有明显提高。取受精卵进行实验也得到了类似的结果,以上实验数据提示Skp1抗体注射后能明显提高卵细胞和受精卵出现纺锤体形态及染色体排列异常的机率。同时我们还进行了染色体核型分析实验,取受精卵进行Skp1抗体注射后通过Giemsa染色的方法观察染色体的数目,结果发现注射抗体的实验组胚胎出现非整倍体的机率相对于对照组明显提高,非整倍体率达到46.4%,这说明Skp1蛋白的阻断会诱使胚胎出现非整倍体。在体实验把处理过的胚胎移植到假孕母鼠子宫内,发现实验组平均产仔数为3.6个,明显低于正常对照组的7个,仔鼠死亡率也有所上升。通过以上的实验,我们发现Skp1蛋白的阻断虽然能促进胚胎的发育,但这些发育得到促进的胚胎出现纺锤体形态染色体排列异常及非整倍体的机率也明显提高,从而导致产仔数降低与新生鼠的死亡。这与前人研究的结果是一致的,因此我们推测在哺乳动物中Skp1蛋白可能与纺锤体checkpoint蛋白相互作用从而参与纺锤体checkpoint激活及信号传递。综上,我们研究了Skp1蛋白在小鼠卵细胞及胚胎中的定位表达,发现Skp1蛋白的超表达能阻滞胚胎的发育,而Skp1蛋白的阻断则能促进胚胎的发育,进一步研究发现这些发育促进的胚胎出现纺锤体形态异常及非整倍体的机率明显提高,从而导致胚胎移植后产仔数降低及新生鼠死亡率提高。我们的研究证实了Skp1蛋白在小鼠早期胚胎发育过程中起关键作用,并推测哺乳动物中Skp1在激活和维持纺锤体checkpoint通路过程中发挥重要作用。