利用基因芯片技术筛选棉纤维发育相关基因

论文摘要

高产适应性广的陆地棉和优质海岛棉来自于同一四倍体祖先,但是,种间差异在基因表达水平上的表现迄今研究甚少。陆地棉以高产,海岛棉以纤维长、强、细著称于世。然而,经过长达一百多万年的进化和分歧,这两个四倍体栽培种积累了重要的遗传差异而导致种间隔离。虽然两者杂交可产生较强的杂种一代优势,但杂种二代以后出现杂种衰败（hybrid breakdown）,导致转移优异海岛棉基因到陆地棉中极其困难。为了解决杂种衰败问题并回避遗传背景的影响,回交并自交培育回交近交系（backcross inbred lines）成为了一个极其重要的遗传材料。虽然已有许多关于控制纤维发育发育的数量性状（QTLs）的报导。但是其分子基础机制还尚不清楚。本研究利用回交近交系,通过三年四环境的田间数据,选取在纤维长度、强度、细度上差异极大的17个回交近交系为材料,并对表现出极端值的材料进行分组,应用Affymetrix棉花基因芯片分析比较分析17个回交近交系以及亲本海岛棉Giza75和陆地棉SG747纤维发育10天时的基因表达谱。以筛选与棉纤维发育相关基因,为以后克隆及验证来自于海岛棉的纤维发育相关基因提供重要参考。本论文主要研究结果如下:1.海岛棉Giza75和陆地棉SG747为两个四倍体栽培种的代表,本研究采用Affymetrix棉花基因芯片技术,比较分析海岛棉Giza75和陆地棉SG747纤维发育10天时的基因表达谱,在24,029条转录本中,按其差异显著性标准筛选出在两个基因型中差异表达的转录本5757条,占筛选转录本总数的23.96 %;其中差异表达倍数在2倍或2倍以上的转录本有3095条,占筛选转录本总数的12.88 %。2.利用COG数据库,对海岛棉Giza75有表达的12837个EST和陆地棉SG747有表达的13387个EST分别进行功能预测,并对结果进行卡方测验。结果发现,除了三个方面,海岛棉和陆地棉均在0.01和0.05水平上表现出差异,说明海岛棉和陆地棉在功能预测方面存在较大的差异。3.对海陆12个差异表达明显以及与纤维发育相关的基因（SAHH, CESA4,α-expansin 2, TUA6, TUA7,β- tubulin 1,β- tubulin 10,β- tubulin 18,和4个未知功能基因）进行实时荧光定量PCR的检测。发现其中11个基因的表达模式具有极高的吻合度,表明了棉花基因组芯片实验及其数据分析具有较高的准确性和可靠性。并研究海岛棉和陆地棉的基因表达量差异。4.方差分析田间数据,选取在纤维长度、强度、细度上差异极大的回交近交系为材料,并对表现出极端值的材料进行分组,利用比较芯片分析筛选在棉花纤维发育快速伸长期开花后10天的棉纤维发育相关基因。在P=0.05时,按差异显著性标准筛选出在纤维长度、强度和细度分组中差异表达的转录本分别为1490条,1038条和259条。5.对这些差异表达的基因通过GO进行功能注释,对差异表达基因的功能注释分析显示,在纤维长度、强度、细度分组的差异基因中分别有34个、26个、7个基因有完整的功能注释信息。通过COG进行功能预测,这些差异表达的基因中功能预测基因和翻译、核糖体结构相关基因,翻译后修饰、蛋白质转换相关基因是三个主要的分类。通过KOBAS进行KEGG途径分析。6.根据P-value值和Fold-Change值,在分组比对的结果中挑选差异表达的基因。挑选10个纤维发育相关基因（GhiAffx.24025.1.S1at, Ghi.10655.1.S1sat, Ghi.3578.1.S1sat, ACO1, ARF1, SAHH,β-tubulin1,β-tubulin10,TUA6,TUA7）进行实时荧光定量PCR的验证,发现基因的表达趋势在基因芯片和实时定量PCR两种检测手段中表现出相似性。并对这10个基因在不同的组织不问（叶,花,蕾）和纤维发育不同时期（5DPA,10DPA,15DPA,20DPA,25 DPA）的表达量进行检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 棉花纤维的发育过程
• 1.2 棉纤维发育相关基因和EST 研究
• 1.2.1 棉纤维发育相关基因研究进展
• 1.2.2 棉纤维发育相关ESTs 和表达谱研究进展
• 1.3 基因芯片技术及其应用
• 1.3.1 基因芯片的概念
• 1.3.2 基因芯片技术的发展历程
• 1.3.3 基因芯片的分类
• 1.3.4 基因芯片在植物研究中的应用
• 1.3.5 Affymetrix 基因芯片技术
• 1.3.6 基因芯片技术在棉花研究中应用与进展
• 1.4 实时荧光定量PCR 在植物基因表达分析中的应用
• 1.5 本研究的目的意义和主要研究内容
• 第二章 陆海高代回交重组近交系田间表型性状、分子标记以及基因表达谱的比较分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 性状调查
• 2.1.3 田间数据的处理和分析
• 2.1.4 取材方法
• 2.1.5 总RNA 的提取
• 2.1.6 棉花基因组芯片的规格
• 2.1.7 基因芯片杂交试验
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 海陆亲本及其回交后代田间表型性状遗传变异分析
• 2.2.2 海陆亲本及其回交后代SSR 标记的遗传差异分析
• 2.2.3 海陆亲本及其回交后代基因芯片的差异表达分析
• 2.3 小结
• 第三章 纤维发育时期海岛棉与陆地棉差异基因表达的比较分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 田间数据的处理和分析
• 3.1.3 取材方法
• 3.1.4 棉花基因组芯片
• 3.1.5 基因芯片的杂交数据分析
• 3.1.6 差异表达基因的功能预测分类
• 3.1.7 总RNA 的提取和cDNA 的合成
• 3.1.8 RT-PCR 检验
• 3.1.9 实时荧光定量PCR 的检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 田间数据分析结果
• 3.2.2 SSR 分子标记结果
• 3.2.3 基因芯片检测与数据分析结果
• 3.2.4 差异表达基因的功能预测
• 3.2.5 总RNA 和cDNA 的质量鉴定
• 3.2.6 差异表达基因的RT-PCR 检测结果
• 3.2.7 差异表达基因的实时荧光定量PCR 验证
• 3.3 讨论
• 3.3.1 陆地棉与海岛棉种间表型和DNA 与RNA 表达水平上的差异
• 3.3.2 基因芯片结果的实时荧光定量PCR 验证
• 3.3.3 海陆差异表达的纤维发育有关基因
• 3.3.4 不同Tublin 基因的海陆表达差异
• 3.3.5 纤维特异表达的基因
• 3.4 小结
• 第四章 棉纤维长度，强度，细度相关基因表达谱的比较分析以及差异表达基因的筛选及验证
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 田间数据的处理和分析
• 4.1.3 取材方法
• 4.1.4 棉花基因组芯片实验
• 4.1.5 基因芯片的数据分析
• 4.1.6 总RNA 的提取和cDNA 的合成
• 4.1.7 实时荧光定量PCR 的检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 田间数据分析结果
• 4.2.2 棉纤维长度，强度，细度相关基因表达谱分析
• 4.2.3 总RNA 和cDNA 的质量鉴定
• 4.2.4 差异表达基因的实时荧光定量PCR 验证
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介