去势对小鼠主动脉衰老的影响及生理剂量睾酮的干预研究

论文摘要

衰老是生命过程中整个集体形态、结构和功能逐渐衰退现象的总称,是生命过程的必然规律,不可抗拒。按照联合国划分标准来看,当一个社会65岁以上老年人占总人口7%以上时,称之为老年型。据第五次人口普查统计显示,2000年,中国65岁以上老人达8883.44万,占人口结构比重为6.8%,与世界平均水平一致,2005年全国1%人口抽样调查显示,65岁及以上的人口为10045万人,占总人口的7.69%,而至2009年,中国的老龄化比例已达8.3%,显著赶超世界平均水平7.5%。由此看出,中国已经进入了老龄化社会,且中国人口变化的另一个显著特点是有“未富先老”的趋势。随着经济的发展,提高人群的生活质量,延缓衰老成为社会关注的焦点。而衰老相关疾病中,老年人心血管疾病是一个不容忽视的问题。衰老一直是生命科学领域最基本和最神秘的研究之一,随着衰老研究及分子生物学的迅猛发展,衰老机制的研究已经从细胞水平、亚细胞水平逐渐走向分子与基因水平,现已有研究表明,衰老是一个由基因调节的过程,是预先设定的,当前比较肯定的如klotho基因等抗衰老基因,但衰老也受环境因素以及生活方式的影响。据统计,目前比较认可的衰老的机制还包括如自由基损伤说、生物膜损伤学说、端粒缩短学说、线粒体DNA损伤学说、代谢产物交联说、体细胞突变说、差错积累说、免疫紊乱说等等,有自由基学说、线粒体DNA损伤学说、端粒学说、生物膜损伤学说、遗传程序学说、染色体突变学说、差错学说、免疫学说、内分泌学说等。以及在2000年由Franceschi等首次提出的炎性衰老。总体来讲上述这些学说上可分为两大类：即一类为以ROS、糖基化、激素紊乱等损害为代表的环境伤害衰老理论,另一类是以端粒缩短、细胞周期调控因子等为代表的遗传因子程序化衰老理论,前者认为衰老是环境因素对细胞进行性和累积性毁坏的结果；后者认为衰老是机体有序的基因活动,是通过遗传按程序预先安排好的,或为特异的“衰老”基因所表达,或为可用基因的最终耗竭。各种不同的学说均对衰老机制进行了深入的探讨,且走上了将上述理论相融合的时代,即将研究集中在环境因子伤害造成的衰老的遗传程序改变的相关范围之内。随着年龄的增长,血管壁部分细胞衰老,其内皮细胞会发生形态与功能的改变,具体为细胞肥大扁平,内源性一氧化氮分泌减少,呈现出促炎与促栓的表型,其结构也会发生重大变化,包括血管僵硬度增加,血管壁增厚,血管腔扩大,以及血管舒张功能减弱,这些变化改变了各种心脑血管疾病的病理生理机制,这可能是多种增龄相关性疾病,包括主动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）形成的共同机制之一。睾酮是一种类固醇激素,男性体内主要的雄激素,属于一种合成激素,也是一种激素原。有研究表明,随着年龄的增长,男性50岁后体内总睾酮及生物活性睾酮水平逐渐出现明显下降。多项国内外研究表明性激素失衡是引起衰老的重要因素之一,因为睾酮有改善老年人的认知能力、调整人体脂肪肌肉的比例,增加肌肉力量,改善运动能力,减少胰岛素抵抗,抑制血脂异常增加,改善性功能的作用等,故睾酮是否可以延缓衰老值得进一步研究。研究表明老年男性血浆睾酮水平与多种增龄相关性疾病发病率相关,即在一定范围内,随着睾酮水平下降,增龄性疾病的发病率上升。研究表明,一定浓度的睾酮可通过减弱VCAM-1等多个途径来抗动脉粥样硬化的作用,雄激素还具有改善认知能力、炎症反应、抗凋亡作用、抗氧化系统等作用。.我们的上一个课题中研究表明,睾酮在体外干预血管内皮细胞可抑制过氧化氢诱导的内皮细胞衰老,也系统证明了性激素失衡参与和诱发了衰老的发生与发展,适当调节性激素平衡有助于延缓衰老。但睾酮能否改善或延缓主动脉衰老进程,尚需进一步研究。为明确睾酮在干预主动脉衰老进程中的作用,期望其能为增龄相关脉管系统疾病的防治提供新的靶点。本研究以目前公认的衰老标志物：（1）小鼠主动脉组织中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）以及丙二醛（Maleic Dialdehyde, MDA）的含量。（2）小鼠主动脉线粒体DNA （mtDNA）缺失突变的突变率。从机体能量代谢的线粒体着手,从DNA分子水平来探讨抗衰老的方法,具有重要的意义。（3）其组织中去磷酸化Rb蛋白表达的量旨在探讨生理剂量的外源性睾酮对去势小鼠主动脉衰老进程的影响。方法：l实验动物及分组32只C57BL/6J雄性小鼠,其中24只为8周龄,随机取16只去势,另取8只为18月龄自然衰老C57BL/6J雄小鼠。分组如下：正常组（n=8）,去势组（n=8）,去势+生理剂量的丙酸睾酮（T）组（n=8）,自然衰老组（n=8）。2制作去势小鼠模型：随机选取16只8周龄的C57 BL/6J小鼠切除睾丸并缝合阴囊。3血清睾酮浓度的检测：用ELISA试剂盒检测雄性小鼠血清睾酮水平。4 MDA及SOD浓度的检测：MDA采用硫代巴比妥酸法,SOD采用Oyanagui的亚硝酸盐形成法。严格按试剂盒说明书操作。5各组小鼠主动脉线粒体DNA缺失突变的突变率检测：提取线粒体DNA,严格按申能博彩公司全基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。巢氏PCR以及普通PCR引物设计及合成,巢氏PCR以及普通PCR扩增相应主动脉mtDNA片段。琼脂糖电泳鉴定PCR产物以及凝胶分析系统扫描结果并分析突变率。纯化PCR产物并送鉴定。6 Western-blot法检测磷酸化Rb蛋白表达：提取小鼠主动脉组织的组织总蛋白,BCA测量蛋白浓度。7统计学处理所有数据采用均数±标准差（x±s）来表示,应用spss13.0标准统计软件,各组间采用单因素方差分析（One—Way ANOVA）,线性关联性分析采用线性趋势检验。p<0.05为具有统计学意义。结果：1、各组小鼠血清睾酮水平与正常组相比较,去势组与自然衰老组小鼠血清睾酮水平均显著降低（P=0.000）,且正常组与去势+生理量睾酮组之间、去势组与自然衰老组之间无统计学差异,注射外源性睾酮后,去势小鼠血清睾酮水平均恢复到正常水平。2、各组小鼠主动脉组织MDA含量、SOD活性的比较与正常组小鼠比较,衰老组、去势组主动脉组织中MDA含量升高,SOD活性降低（P均为0.000）；而给予生理剂量的睾酮3个月后,MDA含量、SOD活性差异无统计学意义（P>0.05）。与衰老组比较,去势+T组小鼠主动脉组织中MDA含量降低,SOD活性增高（P均为0.000）；去势组主动脉组织中MDA含量以及SOD活性差异无统计学意义（P分别为0.575和0.226）。3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果四组C57 BL/6J小鼠主动脉线粒体DNA均扩增出4549bp的未突变条带,也均可见916bp、851bp的缺失片段。自然衰老组及去势组可见476bp片段和304bp,去势+T组尚可见304bp。与正常组小鼠主动脉mtDNA突变率相比,去势组与自然衰老组突变率明显增加（P=0.000）,且正常组与去势+T组、自然衰老组与去势组之间的差异均无统计学意义,其P值分别为0.220、0.221。即补充外源性丙酸睾酮后,去势小鼠主动脉mtDNA突变率明显降低（P=0.000）。其中睾酮浓度与小鼠主动脉mtDNA缺失突变率相关系数为0.720。PCR产物测序结果,用巢氏PCR第二轮所用到的引物F3、F4用于检测缺失型mtDNA片段的序列,该过程是由上海英骏生物工程有限公司（广州分公司）检测,证明衰老和去势小鼠存在3713、3864、4236、4415的缺失突变,其共同特点是前后均有各自相似的两段序列。4、各组小鼠主动脉组织去磷酸化Rb蛋白表达比较与正常组小鼠比较,去势组小鼠心肌组织去磷酸化Rb蛋白表达量增加（P=0.001）；给予生理剂量睾酮干预3个月后主动脉组织去磷酸化Rb蛋白表达量较去势组减少（P=0.001）,与正常组相比无统计学差异（P=0.873）；自然衰老组小鼠心肌组织去磷酸化Rb蛋白表达量增加（P=0.000）。与自然衰老组小鼠相比,去势组小鼠主动脉组织去磷酸化Rb蛋白表达量无统计学意义（P=0.410）,去势+T组去磷酸化Rb蛋白表达量减少（P=0.000）。结论：1、去势后的C57BL/6J雄性小鼠主动脉组织衰老进程加快,其去势后3个月的主动脉衰老程度与自然衰老（18月龄）雄鼠无统计学差异；而与正常饲养未去势的雄性小鼠相比,其主动脉衰老程度有显著统计学差异。即雄激素缺乏加快了小鼠主动脉的衰老进程。2、而给予了外源性生理剂量睾酮的雄性小鼠,其主动脉的衰老程度与去势小鼠的差异具有统计学意义,且其与正常组相比衰老程度的差异无统计学意义。外源性生理剂量的睾酮延缓小鼠主动脉衰老进程。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、材料与方法
• 二、结果
• 三、讨论
• 四、小结和研究展望
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 论文发表情况
• 致谢
• 统计学证明