组织工程桥接管治疗坐骨神经损伤的实验研究

论文摘要

周围神经损伤是创伤外科的一种常见病、多发病。神经损伤后致使支配区的感觉及运动障碍,常常导致肌肉瘫痪、萎缩,甚至留下终生残疾。目前对周围神经损伤尚无比较理想的治疗方法。因此,从根本上促进神经纤维再生、重建神经通路是创伤外科和康复医学中的研究热点。许多学者从多方面、用多种技术方法对周围神经损伤后的病理变化、再生状况进行了试验和检测,例如对横断神经两断端进行套管桥接、局部应用神经营养因子等方法以修复损伤的神经,虽然取得了不少成绩,但仍未找到促进神经再生、重建神经通路的理想方法。近来,组织工程技术的发展为周围神经损伤的治疗开辟了新的思路,该项技术是利用生物可降解性材料结合种子细胞修复疾病或损伤的组织。将组织工程技术运用于周围神经再生和修复中,是近年来创伤外科中的一个研究热点。生物可降解性支架材料和种子细胞的优化精选是组织工程的关键。壳聚糖是近年来发现的天然海洋类高分子化合物,具有多孔性、可降解吸收性及组织相容性强等特点,已被广泛应用于组织工程支架材料。而单一壳聚糖膜带大量正电荷,对细胞粘附性过强,不利于细胞的增殖。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,具有良好的生物相容性及细胞粘附性,对细胞的增殖、分化和迁移有着重要的作用,而且对轴突再生也有重要的作用。但是,胶原单独作为组织工程支架材料,强度上不尽如人意,且降解速度比较快,本实验将胶原与壳聚糖复合制作的支架材料,既可使壳聚糖的吸附能力有一定程度的下降,又可通过胶原和壳聚糖的交联作用调节支架的降解速度。雪旺细胞（Schwann cell,SCs）既可引导神经轴索的定向生长,又能分泌多种神经营养因子,促进轴突的再生,是比较理想的种子细胞。然而自体来源的SCs难以大量获得,且需二次手术;而异体来源的SCs则存在免疫排斥反应等,因此有必要继续寻找更为实用的种子细胞。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）是一类具有自我更新及多潜能分化倾向的未分化细胞,可以分化为神经元和神经胶质细胞,而且神经干细胞免疫源性弱,可以诱导分化为雪旺细胞,是神经组织工程的良好种子细胞。神经上皮干细胞起源于早期胚胎的神经管和神经板,是最原始的神经干细胞,具有更活跃的增殖能力和很大的分化潜能,与神经系统最具同源性,将神经上皮干细胞应用于神经组织工程有着良好的应用前景。目前将神经上皮干细胞与胶原-壳聚糖制作组织工程桥接管用以修复周围神经损伤的研究,尚未见报道。基于以上理念,我们设计了本项实验:用胶原蛋白和壳聚糖按3∶1的比例采用冷冻干燥法制成胶原-壳聚糖支架材料;从孕11.5d、Wistar大鼠的胚胎神经管分离神经上皮干细胞并进行体外扩增;将神经上皮干细胞种植在胶原-壳聚糖支架材料上,并应用扫描电镜观察了神经上皮干细胞在胶原-壳聚糖支架材料上的存活及生长情况;应用该组织工程导管桥接了缺损的大鼠坐骨神经,术后进行电生理、组织学、透射电镜及逆行示踪检测,观察了周围神经再生及神经通路重建的状况,以期为临床修复周围神经损伤提供实验依据。结果显示,从神经管取材的神经上皮干细胞在无血清培养基内可以增殖并形成神经球,nestin免疫细胞化学染色呈强阳性,表明扩增的细胞为神经干细胞;将神经上皮干细胞接种在胶原-壳聚糖支架材料上行扫描电镜观察,可见神经上皮干细胞贴附在胶原-壳聚糖材料表面,存活良好,表明神经上皮干细胞与胶原-壳聚糖支架材料有良好的相容性;桥接手术后,电生理检测结果显示,含神经上皮干细胞的胶原.壳聚糖导管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯胶原-壳聚糖导管桥接组（均P＜0.01）;甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示,含神经上皮干细胞的胶原-壳聚糖导管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显,再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯胶原-壳聚糖导管桥接组（均P＜0.01）。透射电镜观察结果显示,含神经上皮干细胞的胶原-壳聚糖导管桥接组较单纯胶原-壳聚糖导管桥接组再生纤维数目多,神经纤维粗大,髓鞘厚;逆行神经示踪结果显示,在脊髓灰质前角中可检测到荧光示踪剂标记的神经元,含神经上皮干细胞的胶原-壳聚糖导管桥接组标记的阳性细胞明显多于单纯胶原-壳聚糖导管桥接组;BrdU和S-100免疫荧光双染结果显示,在桥接部位具有BrdU和S-100双阳性细胞,表明移植的神经上皮干细胞可以分化为雪旺细胞。本实验结果显示,胶原-壳聚糖支架材料与神经上皮干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性,其中的神经上皮干细胞可分化为雪旺细胞,以此桥接缺损的周围神经,可促进其再生和修复。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
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